基于OAV和GC-O-MS法鉴定香椿中的关键香气成分

赵丽丽，史冠莹，蒋鹏飞，张乐，王旭增，王赵改

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南郑州 450000）

香椿[Toona sinensis（A.Juss.）Roem]，又名香椿头、椿树、椿芽等，为楝科香椿属落叶乔木，起源于中国，已有2 300 多年的栽培历史[1]，自然分布于亚洲地区，是我国特有的集食用、药用、材用和观赏价值于一身的木本风味植物资源之一[2]。香椿种植区域广泛，在我国28 个省市自治区均有分布和种植，栽培面积逐年扩大，产量和产值稳步提升。目前，我国香椿现有栽培面积200 余万亩，年产椿芽10 余万t，年产椿木约6.0×105m3，年产值超100 亿元，已发展成我国“富民工程”的现代特色农业。香椿嫩芽不仅富含人体所必需的氨基酸、蛋白质、维生素和微量元素等多种营养成分[3]，食用价值极高，且富含黄酮、皂苷、生物碱等多种生物活性成分，具有一定的药用价值[4,5]。此外，香椿嫩芽香气浓郁，口味独特，深受广大消费者喜爱，同时也是影响消费者对产品选择的最关键因素。香椿的芳香成分对于杀菌驱虫[6]、香精调配、香椿产地及品种鉴定[7]等均有重要意义。因此，对香椿香气的研究显得尤为重要。

目前香椿中鉴定出的挥发性物质有200 多种，包括含硫类、醛类、萜烯类、醇类、酮类、酯类、酚类、酸类及烃类等[7]。然而，香椿中香气存在易散失、热敏性、易被破坏等不稳定现象[8,9]，在提取过程中易发生氧化、聚合、缩合、基团转移等反应，故适当的香气物质提取技术对于香气分析显得尤为重要。固相微萃取（Solid-phase Microextraction，SPME）作为一种集采样、萃取、浓缩、进样于一体的样品前处理技术，无需使用有机溶剂，能够尽可能地减少香气物质的损失，较为真实地反映样品的香气组成[10]。溶剂辅助风味蒸发（Solvent-assisted Flavor Evaporation，SAFE）是一种在低温高真空及液氮冷凝条件下，将萃取物中挥发性成分蒸发分离出的方法，其能够减少样品中热敏性挥发性成分的损失，更好的保留样品原有的自然、逼真的香味[11]。杨梦云等[12]采用SAFE 法提取新鲜野韭菜花精油，能够有效减少热敏性成分甲基硫代亚磺酸甲酯、甲基硫代磺酸甲酯的分解，更好的保持新鲜野韭菜花的原有香气成分。陈海涛等[13]采用SAFE 法提取并鉴定新鲜大蒜和炸蒜油中的关键性风味成分，全面对比分析了新鲜大蒜和炸蒜油的挥发性风味成分差异。SPME 和SAFE 两种方法均能够在较低的温度下实现香气成分的萃取，避免高温造成热敏性香气物质的损失。然而，SAFE 法在提取香气成分后要进行浓缩和脱水，浓缩过程较长，会使低沸点、高挥发性香气成分有所损失，从而使检测到的香气成分种类和含量降低，造成SAFE 在精确定量方面有一定的局限性[14]。而SPME 法则是依据相似相容原理，根据萃取头的选择性吸附作用，更易萃取出易挥发的物质，对高沸点长链化合物的萃取效果则较差[15]。因此只有将两种方法结合，才能够较为真实地反映出样品的实际香气组成。

香气活度值（Odor Activity Value，OAV）是香气化合物浓度与阈值的比值，用于评价该成分对整体风味的贡献度，化合物的OAV 大于等于1 时，认为该化合物对整体风味有贡献作用，值越大则贡献度越大[16]。气相色谱-嗅闻-质谱联用（Gas Chromatography-Olfactometry-mass Spectrometry，GC-O-MS）技术能够将色谱的分离能力、质谱的定性技术与人类鼻子的灵敏性相结合，使研究者可对挥发性风味活性物质的香型和强度进行定性定量评价[17]，已广泛应用于食品香气研究中[18]，但由于主观因素，不同的嗅闻人员因存在敏感度、身体状态等多方面差异，导致对同一香气成分的香气描述和强度值打分存在人为误差[19]。故OAV 和GC-O-MS 两种方法互为补充，能够全面对样品中的香气化合物进行鉴定。

本研究以新鲜香椿为原料，采用SPME 和SAFE两种样品前处理方法分离提取香椿中的香气成分，使用质谱（MS）和保留指数（RI）进行定性分析，并通过加入内标的半定量方法分析香气物质含量，同时结合OAV 及GC-O-MS 法对其关键呈香成分进行分析鉴定，以期为香椿香气的理化属性研究奠定基础，同时为香椿香料香精产业的发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红油香椿样品于2020年4月采自河南省登封市三一香椿示范基地。

C6～C30 正构烷烃（色谱纯，用于计算保留指数），美国Supelco 公司；内标物2-甲基-3-庚酮，德国DR 公司；二氯甲烷（色谱纯）、无水乙醚（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、氯化钠（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。液氮，郑州博越商贸股份有限公司。

1.2 仪器与设备

8890A-5977B 气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Sniffer 9100 型嗅觉检测器，德国Gerstel 公司；高真空泵组，北京中科科仪技术发展有限公司；溶剂辅助风味蒸发所用玻璃仪器，德国Glasbläserei Bahr；SYC 型超级恒温水槽和DF-101S 集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；顶空固相微萃取装置（包括手持式手柄、50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（ Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头、20 mL带硅胶垫棕色顶空瓶），美国安捷伦公司；YGC-24 氮吹仪，郑州宝晶电子科技有限公司；ME204E 型电子天平，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司；IKA A11 液氮研磨机，艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 样品前处理方法

1.3.1 溶剂辅助风味蒸发（SAFE）

取新鲜香椿，添加适量液氮，使用液氮研磨机进行粉碎。根据前期条件优化结果，准确称取（30.00±0.005）g 粉碎的香椿样品于250 mL 的锥形瓶中，加入150 mL 二氯甲烷，再加入30 μL 质量浓度为10 mg/mL 的2-甲基-3-庚酮作为内标，于常温条件下动态（搅拌速率500 r/min）萃取6 h，混合物抽滤进行固液分离，滤液转移至SAFE 装置的滴液漏斗中。水浴和超级恒温水槽的温度均为25 ℃，用分子扩散泵使真空系统压力保持在2.0×10-3Pa，将有机溶剂浸提液由滴液漏斗缓慢、均匀地滴入蒸馏瓶中。蒸发完毕后，将接收瓶取下，于背光处室温自然融化后，加入无水硫酸钠干燥12 h，将萃取液过滤至圆底烧瓶中，采用韦氏精馏柱浓缩至2.0 mL 左右，并用氮气流缓慢吹扫至总体积约1.0 mL，封口置于-30 ℃的冰箱中备用。

1.3.2 顶空固相微萃取（HS-SPME）

取新鲜香椿，添加适量液氮，使用液氮研磨机进行粉碎。根据前期条件优化[20]，准确称取（1.00±0.005）g粉碎的香椿样品于20 mL带有硅胶垫的棕色顶空瓶中，加入质量浓度为0.25 mg/mL 的2-甲基-3-庚酮5 μL 作为内标，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，萃取头距离样品约1 cm，萃取30 min后取出萃取头，插入GC-MS进样口解吸5 min，同时开始采集保留时间和色谱峰强度等相关数据。

1.4 GC-O-MS 分析条件

1.4.1 GC 条件

HP-5MS 石英毛细管色谱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），5190-4048 超高惰性脱活SPME 玻璃称管，5183-4711分流/不分流通用玻璃称管；载气He（纯度＞99.999%），柱流速1.8 mL/min；进样口温度250 ℃；程序升温：初温40 ℃，保持3 min，以2 ℃/min 的速率升温至70℃，保持2 min；以5 ℃/min 的速率升温至150 ℃，保持2 min；以8 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min结束。SPME 采取顶空进样方式，无分流比；SAFE 采用液体进样方式，进样量1 μL，无分流比。

1.4.2 质谱条件

穿梭线温度230 ℃，电离方式为电子电离（EI），离子阱温度230 ℃，扫描方式全扫描，扫描范围m/z43～800。检索图库：NIST 17.0。SAFE 溶剂延迟时间从5 min 开始至7 min 结束，SPME 无溶剂延迟，调谐文件为标准调谐。

1.4.3 嗅闻条件

样品经GC 分离后分别进入质谱检测器和嗅闻检测器，分流比为1:1；嗅闻口的温度为150 ℃，湿空气以氮气（99.99%）作为辅助气体注入嗅探口，以防止评估者的鼻粘膜干燥，减轻嗅觉疲劳，保持嗅觉灵敏度。

嗅闻分析小组由4 名（1 名男性和3 名女性）经过培训的人员组成。每位评价人员分别对样品进行嗅闻，并记录所嗅闻到的气味特征和气味强度（1=微弱的气味，2=中等强度的气味，3=强烈的气味）。被至少三名成员嗅闻到且香气强度强烈（等于3）的化合物则被认为是关键呈香成分，并通过谱库检索和保留指数（RI）来进行结构鉴定。

1.5 化合物鉴定

1.5.1 定性分析

将GC-MS 得到的质谱图与NIST 2017 数据库的质谱图进行比较，初步确定了匹配度≥60%的化合物。在相同的色谱条件下分析同源系列的正构烷烃（C6-C30），以计算出检测到的化合物的保留指数（RI），并使用同一毛细管柱将其与NIST 2017 数据库中的RI 进行比较。根据Kratz 公式计算：

式中：

Rt(n)和Rt(n+1)——分别为碳数为n和n+1 的正构烷烃的保留时间；

Rt(x)——在碳数为n和n+1 的正构烷烃之间出峰的待鉴定化合物(x)的保留时间。

1.5.2 定量分析

以2-甲基-3-庚酮为内标物，根据2-甲基-3-庚酮的质量浓度与体积、挥发性风味物质的色谱峰面积与2-甲基-3-庚酮的色谱峰面积进行比较，按公式(2)计算挥发性风味物质相对于2-甲基-3-庚酮的含量，认定内标的因子为1。

式中：

C——未知化合物的含量，μg/g；

Ax——未知化合物的峰面积，mAu·s；

A0——内标物的峰面积，mAu·s；

C0——加入内标物的质量浓度，μg/μL；

V——内标物的体积，μL；

m——测定样品的质量，g。

1.5.3 香气活性值（Odor Activity Value，OAV）计算

OAV 是指香气活性成分在样品中的浓度是其自身阈值的倍数，即新鲜香椿中鉴定出的香气活性物质的浓度与其阈值的比值；OAV＞1 的物质被认为是对新鲜香椿的香气贡献大的关键香气成分。OAV 按公式（3）计算：

式中：

Ci——化合物含量；

OTi——该化合物在水中的阈值。

1.6 数据处理

采用Excel 2010 软件计算香气化合物含量，以±s表示，为平均值，s为标准差；作图采用Origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 香椿中挥发性成分分析

由表1可知，通过NIST 谱库检索、保留指数对比共同鉴定出90 种挥发性成分，其中含硫类12 种，醛类11 种，萜烯类34 种，酮类2 种，醇类4 种，酚类1种，酸类1 种，酯类4 种，烷烃类15 种，环烷烃类4种，其他类2 种。其中，SAFE 法共检测到香椿中有效挥发性成分66 种，含硫类5 种，合计相对含量为16.53 μg/g；醛类4 种，合计相对含量为1.22 μg/g；萜烯类25 种，合计相对含量为41.24 μg/g；酮类2 种，合计相对含量为0.35 μg/g；醇类4 种，合计相对含量为6.84 μg/g；酚类1 种，相对含量为1.27 μg/g；酸类1种，相对含量为0.08 μg/g；酯类4 种，合计相对含量为4.22 μg/g；烷烃类15 种，合计相对含量为8.29 μg/g；环烷烃类3 种，合计相对含量为1.95 μg/g；其他类2种，合计相对含量为1.05 μg/g。SPME 法共检测到香椿中有效挥发性成分35 种，含硫类7 种，合计相对含量为88.02 μg/g；醛类9 种，合计相对含量为6.87 μg/g；萜烯类17 种，合计相对含量为21.02 μg/g；酯类1 种，相对含量为0.29 μg/g；环烷烃类1 种，相对含量为0.38 μg/g。由此可见，SAFE 能够萃取到大量的萜烯类和含硫类化合物，而SPME 萃取到的则主要为含硫类化合物。

表1 香椿中挥发性成分组成及含量Table 1 The relative contents of volatile components in Toona sinensis

续表1

续表1

续表1

为了更直观地对比分析SAFE 和SPME 两种方法对香椿挥发性成分的萃取作用，通过图1（两种方法萃取香椿中挥发性化合物的相对百分含量（%））可以看出，在SPME 法鉴定得到的挥发性化合物中，含硫类化合物的相对百分含量最高（75.47%），萜烯类化合物次之（18.04%），醛类化合物占5.91%，酯类和环烷烃类化合物仅占0.58%。在SAFE 法鉴定得到的化合物中，萜烯类化合物的相对百分含量最高（49.66%），含硫类化合物次之（19.90%），酯类和环烷烃类化合物占7.44%，醛类化合物仅占1.47%，相较SPME 新检出了酮类、醇类、酚类、酸类、烷烃类和其他类化合物，其相对百分含量占21.53%。对比分析发现，SPME法能够萃取到较多易挥发的小分子物质，而SAFE 法则萃取出更多如酯类、酸类、烷烃类等高沸点长链化合物。因此，将两种萃取方法结合才能更加全面地对香椿香气成分进行分析。

图1 顶空固相微萃取和溶剂辅助风味蒸发法萃取香椿中挥发性化合物的相对百分含量(%)Fig.1 The relative percentage content of volatile components in Toona sinensis by SPME and SAFE method

2.2 香气成分的OAV 分析

为了确定新鲜香椿中香气化合物对样品的香气贡献，根据定量结果和它们各自的阈值[21-23]，计算了香气活性值，所得结果见表2。SPME 法共鉴定出15 种OAV值大于1 的香气化合物，包括含硫类6 种（2-甲基环硫乙烷、2,5-二甲基噻吩、(E,Z)-二丙烯基二硫醚、(E,E)-二丙烯基二硫醚、(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩），醛类6 种（己醛、2-己烯醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛、3-甲基-正丁醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛），萜烯类3 种（石竹烯、蛇麻烯、苯乙烯）。其中(E,Z)-二丙烯基二硫醚、(E,E)-二丙烯基二硫醚、(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷的OAV 值最大，均大于1 000，被认为对香椿香气具有重要贡献；其次是己醛、3-甲基-正丁醛、反-2-辛烯醛，其OAV 值均大于50，同样对香椿香气具有重要贡献。而SAFE 法共鉴定出11 种OAV值大于1 的挥发性化合物，包括醛类3 种（反-2-己烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛），萜烯类5 种（石竹烯、蛇麻烯、苯乙烯、蒎烯、D-柠檬烯），酮类（3,5-辛二烯-2-酮）、酯类（乙酸异戊酯）、其他类（石竹烯氧化物）各1 种。其中，反-2-己烯醛的OAV 值最大、蒎烯、乙酸异戊酯、石竹烯氧化物的OAV 值次之，均大于30，对香椿香气具有一定的贡献。

表2 香椿中香气活性成分Table 2 The odor-active compounds in Toona sinensis

综合SPME 和SAFE 两种样品前处理方法，共有22 个香气成分的OAV 值大于1，其中(E,Z)-二丙烯基二硫醚、(E,E)-二丙烯基二硫醚、(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷、己醛、3-甲基-正丁醛、反-2-己烯醛、反-2-辛烯醛等具有较高的OAV 值，其OAV 值均大于50，对香椿的特征香气具有重要贡献。(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚具有类似烤洋葱味，其气味阈值极低，仅为0.003 4 μg/kg；反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩具有煮熟洋葱的、类似香椿的气味，其气味阈值为0.039 μg/kg；2-甲基环硫乙烷具有硫磺、葱等刺激的气味，其气味阈值为1.00 μg/kg。上述含硫物质因具有极低的气味阈值，从而呈现出极高的香气活性值，推测对香椿典型的葱蒜、刺激味起关键贡献作用。己醛气味阈值为2.40 μg/kg，具有绿色、青草气味；反-2-己烯醛气味阈值为17 μg/kg，具有果香、绿叶香气；反-2-辛烯醛气味阈值为3 μg/kg，具有水果香气。上述醛类化合物推测对香椿典型的绿色、清香味起关键贡献作用。3-甲基-正丁醛气味阈值为0.50 μg/kg，具有麦芽、黑巧克力香气。特别需要指出的是，上述香气成分（除反-2-己烯醛）在SAFE 提取物中并没有检测出，而是通过SPME 鉴定出，这可能是由于该类化合物的高挥发性导致其在SAFE 提取浓缩过程中损失。

2.3 香气成分的GC-O-MS 嗅闻分析

香椿基质复杂，挥发性成分众多，彼此之间相互协调、共同呈味。其中少部分挥发性组分起主导作用，为关键呈香成分或香气活性成分[24]。根据GC-O-MS 嗅闻结果，香椿的香气成分主要分为辛辣刺激味、葱味、蒜味、青草味、果香、花香等。如表3所示，两种方法共嗅闻出22 种香气成分，其中定性出16 种成分，包括含硫类8 种，醛类5 种，酮类1 种，萜烯类2 种。有6 种香气成分未被鉴定出，依次被命名为未知1～6，分别具有明显的蒜味、刺激味、塑料味、葱味、花香、甜香等香气特征，这些香气成分强度值的范围为1～3，对香椿香气具有一定的贡献。但可能归因于相应化合物为痕量物质，且存在GC-O 的共流出现象，从而导致上述6 种香气成分未被GC-MS 检测鉴定出来，需要提高色谱的分离度或质谱的分辨率对该类物质做进一步定性分析。

表3 GC-O-MS 嗅闻分析Table 3 The sniffing analysis by GC-O-MS

通过SPME 嗅闻出14 种香气成分，共鉴定出11种，包括6 种含硫类，4 种醛类，1 种萜烯类。其中，(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚（类似烤洋葱味）、2-甲基环硫乙烷（蒜、辛辣味）、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩（烤洋葱、类似香椿味）等含硫类化合物呈现出较高的气味强度值（3），对香椿整体风味贡献较大；己醛（青草香、果香）等醛类化合物也呈现出较高的气味强度值（3），同样也对香椿整体风味具有较大贡献。SAFE 共嗅闻出14 种香气成分，却仅鉴定出6 种，包括2 种含硫类，2 种醛类，1 种酮类，1 种萜烯类。值得注意的是，在GC-O 嗅闻实验中发现有4个时间点，其对应挥发物在SAFE 提取液中含量低于GC-MS 检测限而未被鉴定出，但其较低的阈值可通过GC-O 明显嗅闻到与SPME 相同的香气，如表3“*”所示。其中，(E,E)-二丙烯基二硫醚（类似烤洋葱味）、反-2-己烯醛（青草香，果香）呈现出最高的气味强度值（3），(E,E)-2,4-庚二烯醛（蔬菜味、苦芹味）、3,5-二甲基苯甲醛（蔬菜、苦味）、3-乙基-4-甲基-吡咯-2,5-二酮（甜香）等也呈现出较高的气味强度值（2.5）。结合SPME 及SAFE 两种样品前处理方法，认为(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、2-甲基环硫乙烷、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、己醛、反-2-己烯醛等共同对香椿特征香气具有重要贡献作用，这与研究人员[8,25,26]对香椿的研究结果具有相似之处。

2.4 OAV 和GC-O-MS 对比分析

经OAV 值计算，确定出(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷、己醛、3-甲基-正丁醛、反-2-己烯醛、反-2-辛烯醛等9 种香气成分；经GC-O-MS 分析，共鉴定出(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、2-甲基环硫乙烷、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、己醛、反-2-己烯醛等7 种香气活性物质。因此，两种方法共同确定的关键香气成分有：(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷、己醛和反-2-己烯醛。

可见，这两种方法在鉴定香椿关键香气化合物方面具有一致性，即香气强度值大的成分，其OAV 值也较大。但两种方法也存在一定的差异性，如3-甲基-正丁醛虽具有高的OAV 值，但其气味强度值却不高；相反，OAV 值相对较小的(E,E)-2,4-庚二烯醛，其气味强度值却较大，这可能是由于香气成分在不同环境基质中气味阈值不同，从而导致OAV 值的计算结果存在偏差，也可能是GC-O-MS 法在衡量香气成分贡献度时由于嗅闻人员自身的原因出现问题，从而导致两种方法结果出现矛盾。综合OAV 和GC-O-MS 分析，最终确认香椿中关键香气化合物为(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷、己醛和反-2-己烯醛。己醛和反-2-己烯醛主要贡献香椿的青草香，(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、2-甲基环硫乙烷、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩等含硫类化合物主要贡献香椿的辛辣刺激味。

3 结论

本研究采用SPME 和SAFE 两种样品前处理方法，在新鲜香椿中共鉴定出90 种挥发性化合物。进一步结合OAV 和GC-O-MS 法，确认新鲜香椿中关键香气成分为(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、2-甲基环硫乙烷、己醛、反-2-己烯醛。与现有文献结果一致，(E,E)/(E,Z)/(Z,Z)-二丙烯基二硫醚、2-甲基环硫乙烷、反-2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩等含硫类化合物主要贡献香椿的辛辣刺激味，己醛和反-2-己烯醛主要贡献香椿的青草香，均被认为是香椿典型的特征香气物质[8,25,26]。值得关注的是，前期大量文献报道，香椿含硫香气成分存在易散失、热敏性、易被破坏等不稳定现象[8,9,27]，而本文采用的SPME 和SAFE 两种样品前处理方法，均能够在较低的温度下实现香气成分的萃取，避免了高温造成热敏性香气物质的损失，同时又能兼顾高挥发性和高沸点低挥发性化合物的全面萃取，更为真实地反映出新鲜香椿的实际香气组成。因此，本研究为香椿香气的理化属性研究提供了一定的科学依据，同时为香椿加工产品及香椿香料香精的合成奠定了基础。