白簕中性多糖对2型糖尿病小鼠肠道二糖酶的调节作用

2022-12-14刘悦杨慧文林榆子潘静华廖程娟潘育方

现代食品科技 2022年11期

刘悦，杨慧文，林榆子，潘静华，廖程娟，潘育方

（广东药科大学药学院，广东广州 510006）

2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）属于慢性代谢紊乱疾病，患者因肝脏糖脂代谢受损，从而导致胰岛素抵抗和血糖升高[1]。最新流行病学调查数据显示[2]，截至2020年我国的2 型糖尿病患病率已高达11.2%，患病人数位居世界第一。为了应对糖尿病，全球每年的投入超过8270 亿美元，其中中国政府每年投入近250 亿美元，占医疗总支出的13%，可见我国糖尿病防治工作仍面临巨大挑战。天然植物多糖是由10 个以上单糖分子通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物[3]，参与生物体各项生命活动，来源广泛、低毒、副作用小，越来越多的研究表明，天然植物多糖具有良好的降糖效果，探究其在防治糖尿病方面的应用已成为热点。

白簕（Acanthopanax trifoliatus(L.) Merr）为五加科五加属攀援状灌木，民间以“簕菜”而著名。簕菜是人们日常生活中喜爱吃的野生蔬菜和营养保健食品，其作为蔬菜用于食疗有着悠久的历史。目前恩平簕菜已被评为“国家农产品地理标志产品”。本课题组在对白簕粗多糖进行分离纯化后，得到均一组分白簕中性多糖ATP1-1，其重均相对分子质量Mw为2,310，分布系数D为1.02，主要由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖组成，摩尔比为5.52:0.63:0.62:0.56[4]。前期研究发现，ATP1-1 具有降糖功效，是一种潜在的降糖保健食品。然而由于较大的分子量和良好的水溶性，天然活性多糖大多口服生物利用度较差[5,6]，ATP1-1 也具有类似的特点，因此通过肠道相关靶点发挥降糖作用可能是ATP1-1 改善糖尿病的机制之一。肠道上的α-葡萄糖苷酶是治疗2 型糖尿病的一个重要靶点，其活性增加可加速碳水化合物在肠道内的分解，使肠道对糖的吸收加快，最终引起餐后血糖升高[7,8]。小肠刷状缘上皮细胞上的二糖酶-蔗糖酶、麦芽糖酶皆属于α-葡萄糖苷酶，研究表明[9-11]，植物多糖多具有较强的二糖酶抑制活性，其可通过抑制该酶使碳水化合物的消化延迟，进而导致小肠分泌细胞碳水化合物浓度增加，小肠分泌细胞中富含胰高血糖素样肽-1（GLP-1），碳水化合物的浓度增加可通过渗透作用进一步刺激GLP-1 的分泌，从而促进胰岛素生成和降低胰高血糖素分泌[12,13]。基于以上，本研究拟探讨ATP1-1 对2型糖尿病小鼠肠黏膜上二糖酶的影响，并对肠道上GLP-1 的表达进行测定，考察ATP1-1 是否通过影响肠道二糖酶进而对机体血糖产生多方面的调节作用，为白簕多糖在开发保健食品方面的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

超低温冰箱，中科美菱低温科技有限公司；5418R低温高速离心机，德国Eppendorf 公司；FA1004 分析天平，上海右一仪器有限公司；数显恒温水浴锅，北京精科华瑞仪器有限公司；Thermo Scientific Mulitskan Sky 全波长酶标仪，赛默飞（中国）有限公司；JXFSTPRP-24 全自动样品快速研磨仪，上海净信实业发展有限公司；Nano-100 微量分光光度计，杭州奥盛仪器有限公司；C1000TMThermal cycle PCR、C1000TouchTMThermal cycle 荧光定量PCR 仪，美国Bio-Rad 公司。

1.1.2 药物与试剂

白簕采购于广东省恩平市，经广东药科大学刘基柱副教授鉴定为五加科植物白簕（Acanthopanax trifoliatus(L.) Merr.），标本保存于广东药科大学中药学院标本馆。白簕中性多糖ATP1-1 具体提取方法见文献[4]。

链脲佐菌素，美国Sigma 公司；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 值4.5，vigonob）；阿卡波糖，上海麦克林生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖，广东光华科技股份有限公司；麦芽糖，天津市大茂化学试剂厂；蔗糖酶、麦芽糖酶活性测定试剂盒、葡萄糖测定试剂盒、蛋白测定试剂盒，南京建成生物有限公司；磷酸钾缓冲液，北京雷根生物技术有限公司；血糖试纸、血糖仪（安稳型），长沙三诺生物传感技术股份有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS 预混型qPCR 试剂盒，武汉艾瑞科生物科技有限公司。

1.1.3 动物及饲料

SPF 级C57BL/6 雄性小鼠购于广东省医学实验动物中心，（18.0±2.0）g，实验动物生产许可证编号：SCXK（粤）2018-0002。所有动物均饲养于广东药科大学实验动物中心，实验动物使用许可证编号：SYXK（粤）2017-0125。所有方案均通过广东药科大学实验动物中心伦理委员会批准。

基础饲料购自广东省广州市广东药科大学动物实验中心。高脂饲料脂肪质量分数为33.8%，由北京博爱港生物技术有限公司制备。所用配方在文献[14]的基础上进行调整（质量分数）：基础饲料58.5%、蔗糖15%、猪油10%、酪蛋白10%、奶粉5%、胆固醇1%、胆酸钠0.05%。

1.2 方法

1.2.1 模型制备

按文献[15]所述方法采用高脂饲料联合一次大剂量注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导2 型糖尿病小鼠模型。选取60 只C57BL/6 雄性小鼠，SPF环境普通饲料适应性喂养1 周后，按体重随机分为正常组（n=10）和造模组（n=50）。正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂高脂饲料。4 周后，小鼠禁食不禁水过夜，造模组腹腔注射STZ（130 mg/kg，pH 值为4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液避光冰浴配制，现配现用），于注射后第7 天、第10 天将小鼠禁食6 h，测量其空腹血糖值（FBG），以FBG≥16.7 mmoL/L 筛选成模小鼠。

1.2.2 给药治疗

将成模小鼠按血糖随机均分为四组：模型组、二甲双胍组（185 mg/(kg·d)）、ATP1-1 高剂量组（80 mg/(kg·d)）、ATP1-1 低剂量组（40 mg/(kg·d)），另设正常组，给药8 周，模型组与正常组灌胃等量的生理盐水。实验期间每7 d 测量并记录小鼠体重、饮食饮水及空腹血糖。给药期间所有成模小鼠均持续以高脂饲料喂养。

1.2.3 口服葡萄糖、蔗糖、麦芽糖耐量试验

1.2.3.1 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）

于给药第8 周，小鼠禁食不禁水6 h，测定所有小鼠空腹血糖值作为0 min血糖值，随后灌胃给予2.0 g/kg葡萄糖，测定15、30、60、90、150 min 的血糖值，并计算血糖-时间曲线下面积（AUC）评价糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F——分别代表0、15、30、60、90、150 min 的血糖值。

1.2.3.2 口服蔗糖耐量试验（OSTT）

于给药第8 周，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，测定所有小鼠空腹血糖值作为0 min 血糖值，随后各组小鼠灌胃给药，并于30 min 后给予4.0 g/kg 蔗糖溶液，测定30、60、90、120、150、180 min 的血糖值，并计算血糖-时间曲线下面积AUC评价糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F、G——分别代表0、30、60、90、120、150、180 min 的血糖值。

1.2.3.3 口服麦芽糖耐量试验（OMTT）

于给药第8 周，小鼠隔夜禁食不禁水12 h，测定所有小鼠空腹血糖值作为0 min 血糖值，随后各组小鼠灌胃给药，并于30 min 后给予3.0 g/kg 麦芽糖溶液，测定30、60、90、120、180 min 的血糖值，并计算血糖-时间曲线下面积AUC评价糖耐量：

式中：

A、B、C、D、E、F——分别代表0、30、60、90、120、180 min 的血糖值。

1.2.4 ATP1-1 对蔗糖酶、麦芽糖酶活性的体内抑制作用

于给药治疗结束后，取小鼠的十二指肠、空肠、回肠各2 cm，生理盐水冲洗内容物并进行称重。沿中线纵向剪开各肠段，载玻片轻轻刮取肠黏膜，随后用预冷的生理盐水（m:V=1:9）冲洗至1.5 mL 离心管中，研磨仪-30 ℃，60 Hz，60 s，连续匀浆2 次。匀浆混悬液4 ℃，4 000 r/min，离心10 min，吸取上清。用Bradford 蛋白试剂盒测定上清液蛋白含量，并根据二糖酶活性试剂盒测定各肠段蔗糖酶、麦芽糖酶的活性情况。以在37 ℃ pH 值为6.0 的条件下，每毫克蛋白组织每分钟水解1 nmol蔗糖或麦芽糖定义为1个酶活力单位。

1.2.5 ATP1-1 对回肠上SI、GLP-1 表达的影响

取小鼠回肠测定蔗糖酶-异麦芽糖酶复合物（Sucrase-Isomaltase，SI）和GLP-1 的mRNA 表达，采用Trizol 试剂法提取总RNA，利用微量分光光度计检测样本核酸的OD 值，根据PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒合成cDNA，反应条件为：42 ℃，2 min。运用SYBR 法测定各基因表达情况，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40 个循环。以β-actin 为内参基因，引物序列见表1。各目的基因的相对表达量采用2-∆∆Ct法测定。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.2.6 ATP1-1 对蔗糖酶、麦芽糖酶活性的体外抑制作用

试验参照文献[16]并稍加修改，取健康C57BL/6 小鼠十二指肠，加入10 倍预冷的磷酸钾缓冲液，研磨仪-30 ℃，60 Hz，60 s，连续匀浆3 次。匀浆混悬液4 ℃，2 500 r/min，离心15 min，吸取上清液作为酶溶液。

10 mL 试管中加入缓冲液、各浓度白簕中性多糖溶液（10 000、7 000、5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、400、200、50、10、4 μg/mL）或阿卡波糖溶液（400、300、200、100、50、25、10 μg/mL）、蔗糖56 mmol/L 或麦芽糖7 mmol/L 各500 μL，37 ℃水浴孵育5 min，添加500 μL 酶液，在37 ℃水浴下反应45 min，最后，沸水浴5 min 进行灭酶。以底物水解生成葡萄糖的量反映蔗糖酶和麦芽糖酶的活性。通过不同浓度ATP1-1 对蔗糖酶或麦芽糖酶的活性抑制率计算半数抑制浓度（IC50）。抑制率计算公式为：

式中：

H——抑制率，%；

A1——样品组吸光度；

A2——样品对照组吸光度；

A0——空白组吸光度；

A3——阴性对照组吸光度。

以阿卡波糖代替白簕中性多糖作为阳性对照。样品组：样品+底物+酶液；样品对照组：样品+底物+缓冲液；空白组：缓冲液+底物+酶液；阴性对照组：缓冲液+底物+缓冲。

1.3 数据分析

采用Excel 和Graphpad prism 6.0 进行统计分析和作表作图，数据处理后表示为平均值±标准差（X±SD）。两组数据采用Dunnet-t 进行比较，组间多组数据采用LSD 法进行多重比较。

2 结果与讨论

2.1 ATP1-1 对糖尿病小鼠体重、饮食饮水的影响

“三多一少”症状是观察糖尿病最直观的指标。如表2所示，与正常组小鼠相比，造模成功的小鼠体重下降了14.70%，饮食量、饮水量分别增加了18.89%、224.55%，具有明显的糖尿病多饮、多食、体重减轻症状。给药8 周后，各给药组小鼠与模型组小鼠相比，体重明显上升（p＜0.05），饮食饮水量显著下降（p＜0.01），且ATP1-1 高、低剂量组与二甲双胍组相比各指标均无显著性差异（p＞0.05），其中各给药组对小鼠饮水量的改善最为明显，与模型组相比分别下降了40.66%、34.15%、37.58%。宿世震等[17]在研究南瓜多糖对2 型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响中发现，造模后糖尿病小鼠出现多饮、多食、多尿、体重减轻的现象，且在给予南瓜多糖治疗后，以上症状均得到明显改善，这与本研究的结果相似，说明ATP1-1 可使糖尿病小鼠的体重及饮食饮水量趋向于正常小鼠。

表2 ATP1-1 对糖尿病小鼠的体重、饮食饮水的影响Table 2 Effects of ATP1-1 on body weight,diet and water intake in diabetic mice

2.2 ATP1-1 对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

连续8 周监测各组小鼠血糖变化情况，如图1所示，与正常组相比，造模后各组小鼠空腹血糖值均明显升高，表现为高血糖。给药治疗8 周后，模型组血糖为23.65 mmol/L，与模型组相比，各给药组血糖均明显下降，二甲双胍效果最优，下降了40.94%，ATP1-1高、低剂量组血糖浓度分别下降了27.06%、19.96%（p＜0.01）。正常组始终维持在5.73 mmol/L，给药治疗后虽未能达到正常水平，但有明显的改善效果。与化学药物相比，植物多糖[18]疗效好、毒副作用小、不良反应少，其在2 型糖尿病治疗方面应用的研究日渐增多，如沙蒿籽多糖、羊栖菜多糖、灵芝多糖、黄秋葵多糖、太子参多糖等[19-23]，本实验结果表明白簕中性多糖ATP1-1 也可以有效降低2 型糖尿病小鼠空腹血糖值，具有开发价值。

图1 ATP1-1 对糖尿病小鼠空腹血糖的影响Fig.1 Effects of ATP1-1 on FBG in diabetic mice

2.3 ATP1-1 对小鼠糖耐量的调节作用

为了测定ATP1-1 对葡萄糖、蔗糖及麦芽糖耐受的影响，对各组小鼠进行了口服葡萄糖、蔗糖及麦芽糖耐量实验。如图2所示，在OGTT 试验中，口服给予葡萄糖15 min 后各组小鼠血糖达到峰值。30 min 后二甲双胍组与ATP1-1 高剂量组血糖开始回落，1 h 后各给药组血糖值明显下降。计算AUC 可知，模型组AUC 约为正常组的3.08 倍（p＜0.01），给药治疗后，与模型组相比各组小鼠AUC 均明显降低（p＜0.01），且ATP1-1 高、低剂量组结果与二甲双胍组相比均无明显差异（p＞0.05），二者相比模型组，AUC 分别降低了17.67%、9.50%。葡萄糖耐量可反应机体对葡萄糖的耐受能力，葡萄糖耐量异常提示胰岛素敏感性降低和β细胞功能受损，此为2 型糖尿病发病的病理生理学基础上的关键决定因素[24]。AUC 作为反映血糖的一种指标，其比单点的血糖值更能全面地分析血糖波动的时间和程度，该值越小，表明糖耐量改善程度越高，机体血糖恢复能力强[25]。本实验结果提示ATP1-1 可改善2 型糖尿病小鼠葡萄糖耐量，且在该实验条件下，效果与玉米须多糖（20.05%）[26]、南瓜多糖（15.07%～27.97%）[17]等类似。

图2 各组小鼠葡萄糖耐量水平Fig.2 Oral glucose tolerance of different group mice

图3、图4分别为OSTT、OMTT 试验结果，口服给予蔗糖或麦芽糖30 min 后，各组小鼠血糖值达到峰值，其后给药组均以大于模型组的幅度下降，AUC均明显降低（p＜0.05），尤其对蔗糖糖耐量效果最为明显（p＜0.01）。高、低剂量ATP1-1 对蔗糖耐量实验的AUC 与模型组相比分别下降了16.19%、12.11%。2 型糖尿病小鼠的蔗糖糖耐量增高，意味着机体对高糖饮食中蔗糖的吸收调节能力增强，从而可抑制高糖饮食引起的循环血糖增高[27]；糖尿病小鼠的麦芽糖耐量提高则意味着机体对麦芽糖的耐受力增加，可减缓麦芽糖的消化和吸收，改善胰岛素抵抗[28]。蔗糖、麦芽糖消化吸收下降可降低葡萄糖入血从而降低血糖，ATP1-1 可通过加快餐后血糖下降速率改善蔗糖与麦芽糖耐受，且呈剂量依赖性，该作用往往与减缓机体对二糖的消化，延迟吸收从而调节肠道上的葡萄糖摄取有关。

图3 各组小鼠蔗糖耐量水平Fig.3 Oral sugar tolerance of different group mice

图4 各组小鼠麦芽糖耐量水平Fig.4 Oral maltose tolerance of different group mice

2.4 ATP1-1 对T2DM 小鼠肠道二糖酶活性的影响

从表3可知，糖尿病小鼠各肠段的蔗糖酶活性、麦芽糖酶活性均明显高于正常组（p＜0.05），给药治疗8 周后，ATP1-1 高、低剂量组各肠段的蔗糖酶、麦芽糖酶活性被显著抑制（p＜0.05）。其中，高剂量ATP1-1 对十二指肠、空肠、回肠的蔗糖酶抑制率分别为48.29%、75.09%、31.41%；对麦芽糖酶抑制率分别为26.23%、18.34%、34.18%。ATP1-1 对蔗糖酶的活性抑制作用在空肠上最为明显（p＜0.01），对麦芽糖酶的活性抑制作用在回肠上最为明显（p＜0.01），且回肠上高、低剂量治疗后其二糖酶活性与正常组相比差异无统计学意义（p＞0.05）。

表3 ATP1-1 对小鼠肠黏膜蔗糖酶、麦芽糖酶活性的影响Table 3 Effects of ATP1-1 on the activities of invertase and maltase in mouse intestinal mucosa

α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘膜上皮细胞，是水解蔗糖、麦芽糖等双糖的关键酶，是众多经典糖尿病治疗药物的作用靶点，在糖尿病的治疗中起着重要的作用[29]。糖尿病患者中α-糖苷酶活性与正常人相比会异常升高，抑制肠黏膜刷状缘α-糖苷酶活性，可减缓寡糖、双糖水解为单糖的速度，减缓单糖吸收入血，从而降低血糖[8]。蔗糖酶、麦芽糖酶均属于α-葡萄糖苷酶，顾舒静等[30]研究发现，黄芩苷对大鼠十二指肠、空肠和回肠的蔗糖抑制率分别为47.2%、14.4%和34.8%，对麦芽糖酶没有抑制作用；本试验结果表明，ATP1-1 对蔗糖酶、麦芽糖酶活性均有抑制作用，有助于延缓碳水化合物分解成单糖，抑制肠道对糖的吸收，维持血糖在正常水平。

2.5 ATP1-1 对回肠上GLP-1、SI 表达的影响

如图5、图6所示，糖尿病小鼠SI mRNA 表达量明显高于正常小鼠（p＜0.01），GLP-1 mRNA 表达量明显低于正常组（p＜0.01）。给药8 周后，与模型组相比，ATP1-1 高、低剂量组SI 表达分别降低了64.90%、24.87%（p＜0.01）；高剂量组GLP-1 表达增加了156.46%（p＜0.01），低剂量组有上升趋势但无统计学意义。SI 存在于小肠绒毛刷状缘的黏膜表面，伴随着小肠上皮的成熟逐渐形成，包含了约60%～80%的麦芽糖酶活性、所有的蔗糖酶活性以及大部分的异麦芽糖酶活性[31]。GLP-1 可刺激胰岛素分泌、减少胰高血糖素的分泌、增强β细胞的增殖，抑制胃排空和增加饱腹感来减少对食物的摄入[32]。糖尿病小鼠中SI的表达增加，刺激了肠黏膜细胞膜的转运系统，导致小肠内单糖转运升高[33]。同时，抑制α-葡萄糖苷酶活性可导致回肠远端碳水化合物浓度增加，通过渗透作用，进一步刺激小肠肠促胰岛素GLP-1 的分泌增加[10]。结合本实验结果可见，ATP1-1 可通过下调SI表达，上调GLP-1 表达，从而影响肠道糖的吸收和机体糖代谢。

图5 各组小鼠回肠组织SI mRNA 表达水平Fig.5 The mRNA expression levels of SI in ileum tissues of different group mice

图6 各组小鼠回肠组织GLP-1 mRNA 表达水平Fig.6 The mRNA expression levels of GLP-1 in ileum tissues of different group mice

2.6 ATP1-1 对蔗糖酶、麦芽糖酶活性的体外抑制能力

α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过延迟碳水化合物的肠道吸收，从而抑制餐后血糖水平的升高[34]。为了进一步验证ATP1-1 是否能直接抑制小鼠肠二糖酶，分别以蔗糖、麦芽糖作为底物，研究了ATP1-1 对小鼠十二指肠匀浆中蔗糖酶、麦芽糖酶活性抑制的影响。所有数据平行测定3 次，以阿卡波糖为阳性对照，结果如图7、图8所示，根据抑制率-浓度曲线计算半数抑制浓度IC50，阿卡波糖和ATP1-1 对麦芽糖酶的IC50值分别为42.61 μg/mL、265.00 μg/mL，对蔗糖酶的IC50值分别为2.16 μg/mL、3 381.00 μg/mL，提示ATP1-1 对此两种酶均有直接抑制作用，但抑制能力弱于阿卡波糖。ATP1-1 抑制麦芽糖酶的IC50远小于蔗糖酶，但当ATP1-1 浓度为10 mg/mL 时，其对蔗糖酶的抑制率可达46.80%，远高于对麦芽糖酶的抑制率15.92%，结果与体内活性抑制率相似，且植物多糖如绿茶多糖[35]对蔗糖酶的抑制率小于40%，番石榴叶多糖[36]对蔗糖酶、麦芽糖酶的抑制率仅为29.3%、20.6%，可见ATP1-1 不仅与上述多糖相似可直接抑制小鼠肠二糖酶活性，还具有较好的抑制效果。