HPLC法测定头孢呋辛酯片的含量

头孢呋辛酯又名头孢羟苄四唑甲酸酯、头孢呋辛乙酰氧乙酯。是半合成第二代头孢菌素类药物，具有广谱、杀菌力强、对β-内酰胺酶有内在稳定性，并有良好的人体药代动力学等特点[1-2]。头孢呋辛酯的体外灭菌活性与它同若干关键靶向蛋白的结合抑制细胞壁的合成有关。头孢呋辛酯对多种常见病菌有灭菌活性，对多种细菌β-内酰胺酶稳定，尤其对多种在肠杆菌中习见的质粒介导的酶稳定。本文在文献的基础上[3-6]，建立了头孢呋辛酯片含量测定的高效液相色谱法，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 赛默飞世尔U3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；AB135-S电子天平（十万分之一）（梅特勒托利多）。

1.2 试剂及试药 头孢呋辛酯片（国药集团致君（深圳）制药有限公司）：批号：A211206、A211208、A211210；头孢呋辛酯片（对照药品）：批号：0407016（葛兰素史克集团公司）；头孢呋辛酯对照品：批号：130492-202104（中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯），磷酸二氢铵（分析纯）。

2 含量测定

2.1 含量测定方法 按照高相色谱法（《中国药典》2020年版二部通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇（62∶38）为流动相；检测波长为278nm。取头孢呋辛酯对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，在60℃水浴中加热至少1小时，冷却，得含头孢呋辛酯Δ3-异构体的溶液；另取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，经紫外光照射24小时，得含头孢呋辛酯两个E异构体的溶液。取上述两种溶液各10 l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。头孢呋辛酯A、B异构体、Δ3-异构体与两个E异构体峰的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。头孢呋辛酯A、B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与Δ3-异构体之间的分离度均应符合要求。

测定法：取本品20片，精密称定，研细，混合均匀，精密称取适量（约相当于头孢呋辛0.125g），置100ml量瓶中，加甲醇25ml，强力振摇使溶解，再用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，立即精密量取10 l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢呋辛酯对照品适量，同法测定。按外标法以头孢呋辛酯两主峰面积计算供试品中C16H16N4O8S的含量。

2.2 含量测定方法学验证

2.2.1 系统适用性试验 理论板数（n）：按照高效液相色谱法（《中国药典》2020年版二部通则0512）系统适用性方法下操作，量取头孢呋辛酯对照品溶液10 l，注入色谱仪，记录色谱图，量取保留时间tR和Wh/2，计算头孢呋辛酯A异构体：n=5.54×（tR/Wh/2）2=5.54×（10.399/0.226）2=1.173×104；头孢呋辛酯B异构体：n=5.54×（tR/Wh/2）2=5.54×（11.608/0.290）2=8.876×103。

2.2.2 线性范围考察与标准曲线绘制 精密称取头孢呋辛酯对照品150mg，置50ml容量瓶中，用少量甲醇溶解，再加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取1、2、4、5、7.5、10ml分别置50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密量取溶液10 l注入色谱仪，记录色谱图，量取两个主峰面积，由主峰峰面积之和（A）对溶液浓度（C）线性回归，得回归方程。结果表明：在49.51-495.08 g/ml浓度间，本法线性良好。具体结果见表1、图1。

表1 含量测定标准曲线绘制结果

图1 含量测定标准曲线

2.2.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于日内（0、2、4、6、8h）测定，计算主峰峰面积之和日内差。结果表明：本方法的稳定性良好。具体结果见表2。

表2 含量测定稳定性试验结果

2.2.4 进样精密度 取同一份供试品溶液，连续进样6次，计算六次主峰峰面积之和的相对标准偏差RSD，考察进样精密度。结果表明：本方法进样精密度良好。具体结果见表3。

表3 含量测定进样精密度试验结果

2.2.5 重现性试验 取同一批头孢呋辛酯片，按照含量测定项下的方法，制备6份供试品溶液，依次注入液相色谱仪，计算各次的主峰峰面积之和与称样量之比，计算6次比值的相对标准偏差，考察本方法的重现性，由表中数据可见，本方法重现性良好。具体结果见表4。

表4 重现性试验结果

2.2.6 耐用性试验 取头孢呋辛酯同批样品，按照含量测定项下的方法改变流速及温度，考察耐用性。由结果可见，本方法对柱温及流动相流速的耐用性良好。具体结果见表5。

表5 含量测定耐用性试验结果

2.2.7 中间精密度试验 取本品一批，分别由三位试验者在不同时间测试含量。由结果可见，本方法中间精密度良好。具体结果见表6。

表6 含量测定中间精密度试验结果

2.2.8 准确度试验 取头孢呋辛酯原料约120mg、150mg和180mg各三份，精密称定，分别加入100ml量瓶中，再精密称取处方量辅料（相当于头孢呋辛酯150mg）置量瓶中，用少量甲醇溶解，再加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，按“含量测定”项下试验，测定峰面积，计算回收率。结果显示，本方法准确度良好。具体结果见表7。

表7 含量测定回收率试验结果

2.2.9 定量限 取空白基线一段，测量其噪音峰高，将样品溶液用流动相稀释至适当浓度，精密量取10 l注入液相色谱仪，使2个主峰峰高均约为噪音峰高的10倍，此时的进样浓度为0.025 g/ml，故定量限为0.25ng，具体见图2。

图2 头孢呋辛酯定量限HPLC图

2.2.10 含量测定方法学验证结果 通过对含量方法学验证后，对市售品及自对照药品进行了含量测定，结果见表8。

表8 含量测定方法学验证结果

3 含量测定结果（见表9）

表9 含量测定结果

4 讨论和结论

高效液相色谱法测定头孢呋辛酯含量的液相条件下，头孢呋辛酯A异构体、B异构体、Δ3异构体、E异构体1、E异构体2分离度良好，头孢呋辛酯A异构体、B异构体理论塔板数符合要求，稳定性、精密度、重现性、耐用性、中间精密度和准确度结果也符合要求，表明方法可行，可用于该制剂的含量测定和稳定性分析，并为质量控制提供参考依据。