高效液相色谱法测定替格瑞洛原料药中异构体的含量

蔡丽朋，周 琪

（江西青峰药业有限公司，江西 赣州 341000）

替格瑞洛是英国阿斯利康公司研发的一种选择性小分子抗凝血药物，用于治疗急性冠状动脉综合征（ACS）[1]。替格瑞洛含有6 个手性中心，理论上有2（664）个异构体。对于本公司研制的替格瑞洛原料药，从合成工艺路线考虑，在成品的质量控制中主要需要控制5 种异构体：对映异构体A、非对映异构体B、非对映异构体C，非对映异构体D 及非对映异构体E，替格瑞洛及需控制的异构体结构见图1。文献[2-3]提到了替格瑞洛及其部分异构体的测定方法，但是控制的异构体种类与本公司拟定的控制种类有差异，方法不适用。本研究建立依据拟定的杂质谱测定替格瑞洛异构体含量的方法，并参照《中国药典》2020年版四部通则9101[4]和ICH Q2[5]要求进行方法学验证。

图1 替格瑞洛及需要控制的各异构体结构Fig.1 The structure of ticagrelor and the isomers that need to be controlled

1 仪器与试剂

1.1 仪器

XS105DU 型电子天平（Mettler Toledo 公司）；Waters e2695-2489 型高效液相色谱仪。

1.2 试药与试剂

替格瑞洛对照品（自制，含量99.6%）；替格瑞洛原料药（自制，含量99.1%）；异构体A 对照品（山东博洛德生物科技有限公司（下称博洛德），纯度为99.36%）；异构体B 对照品（博洛德，纯度为98.85%）；异构体C 对照品（博洛德，纯度为99.36%）；异构体DE 混合对照品（博洛德，纯度为95.38%）；无水乙醇、正己烷和异丙醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Phenomenex Lux Cellulose -2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为无水乙醇-正己烷-异丙醇-二乙胺（体积比为55:40:5:0.5）；柱温为20 ℃；检测波长为300 nm；流速为1.0 mL/min；进样体积为50 μL。

2.2 溶液的配制

（1）空白溶剂：异丙醇。

（2）供试品溶液配制：取本品适量，精密称量，加溶剂溶解并定量稀释制成每毫升含替格瑞洛0.25 mg 的溶液。

（3）对照液配制：精密量取供试溶液1.0 mL，置于100 mL 量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。

（4）系统适用性溶液的配制：取替格瑞洛及异构体A、异构体B、异构体C、异构体DE 混合对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成每毫升中含替格瑞洛0.25 mg、上述异构体2.5 μg 的溶液。

2.3 系统适用性要求与结果计算

系统适用性要求：替格瑞洛与异构体C 的分离度不小于2.0。单个异构体含量按式（1）计算。

单个异构体含量（%）=A异构体×f÷A对照×1%（1）

式（1）中：A异构体为供试液中各异构体峰的峰面积；f 为各异构体校正因子；A对照为对照液中主峰面积。

2.4 验证试验

2.4.1 专属性

分别进样空白溶剂、各个异构体的定位溶液及系统适用性溶液，系统适用性典型谱图见图2。从图2 可知，空白溶剂不干扰待测物的测定，出峰顺序依次为：异构体DE 第1 个峰（保留时间为9.609 min），异构体DE 第2 个峰（保留时间为10.834 min），异构体A（保留时间为13.368 min），异构体B（保留时间为15.103 min），异构体C（保留时间为24.148 min）和替格瑞洛（保留时间为29.498 min），替格瑞洛与异构体C 分离度为2.2。

图2 系统适用性溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of system suitability solution

2.4.2 系统适用性

取系统适用性溶液，连续进样6 次，异构体DE 第1 个峰的保留时间的相对标准偏差（RSD）为0.50%，峰面积RSD 为1.30%；异构体DE 第2个峰的保留时间RSD 为0.43%，峰面积RSD 为1.22%；异构体A 的保留时间RSD 为0.34%，峰面积RSD 为0.97%；异构体B 的保留时间RSD 为0.31%，峰面积RSD 为1.15%；异构体C 的保留时间RSD 为0.20%，峰面积RSD 为1.37%；替格瑞洛的保留时间RSD 为0.18%，峰面积RSD 为1.20%。表明本方法的系统适用性良好。

2.4.3 灵敏度

精密称取各异构体对照品，配制成混合溶液，逐级稀释，进样检测，当信噪比为约10 左右作定量限。定量限测试结果：异构体DE 第1 个峰与第2 个峰的绝对检测量均为2.5 ng，相对供试浓度均为0.02%；异构体A、异构体B 与异构体C的绝对检测量均为5.0 ng，相对供试浓度均为0.04%。

2.4.4 线性与范围

精密称取各异构体和替格瑞洛对照品，配制成混合溶液，逐级稀释，配制成相对供试品浓度在0.05%～0.25%的溶液6 份，依2.1 项下色谱方法检测，以溶液中各组分的峰面积A 对相应的溶液浓度C 进行线性回归，绘制标准曲线，结果如下：异构体DE 线性方程为y=72662x-523.62，范围为0.1247～0.6233 μg/mL，r 为0.9991；异构体A的线性方程为y=86911x-349.56，范围为0.1257～0.6286 μg/mL，r 为0.9999；异构体B 的线性方程为y=91471x-318.87，范围为0.1231～0.6157 μg/mL，r为0.9996；异构体C 的线性方程为y=83972x-556.46，范围为 0.1246～0.6228 μg/mL，r 为0.9998；替格瑞洛的线性方程为y=91443x+401.64，范围0.1243～0.6215 μg/mL，r 为0.9995。

2.4.5 校正因子

采用各组分线性方程（y=kx+b）中斜率（k）的比值计算各异构体相对主成分的校正因子，公式为：f=k主成分/k异构体。一般情况下，校正因子在0.9～1.1 时可不予校正，即可以以1 计。各异构体的f计算结果：异构体DE：0.80、异构体A：0.95（以1计）、异构体B：1.00（以1 计）、异构体C：0.92（以1 计）。

2.4.6 精密度

由实验员A 配制6 份供试品溶液，按照2.1项下色谱方法测定；由实验员B 在不同的时间配制6 份供试品溶液，采用不同的仪器，依2.1 项下色谱方法测定，比较12 份样品的检测结果：实验人员A 测定6 份供试品溶液，只检出异构体C，含量在0.06%～0.07%之间，RSD 为6.6%，未检出其他异构体；实验人员B 测定6 份供试品溶液，只检出异构体C，含量在0.05%～0.06%之间，RSD为9.1%，未检出其他异构体；12 份供试品溶液异构体C 的RSD 为8.7%。表明本方法精密度良好。

2.4.7 准确度

精密称取替格瑞洛原料药适量，置于不同的9 个量瓶中，分别加入各异构体储备液，配制成含替格瑞洛相对供试品溶液浓度为100%，各异构体相对供试品溶液浓度（报告限[6]浓度）为0.05%（平行3 份）、相对供试品溶液浓度（限度浓度）为0.15%（平行3 份）、相对供试品溶液浓度为0.25%（平行3 份）的溶液，按照2.1 项下色谱方法测定。9 份供试品溶液中，异构体DE 的平均回收率为92.8%，RSD 为3.6%；异构体A 的平均回收率为95.5%，RSD 为2.2%；异构体B 的平均回收率为102.7%，RSD 为4.3%；异构体C 的平均回收率为99.9%，RSD 为5.5%。表明本法准确度良好。

2.4.8 溶液稳定性

依法配制替格瑞洛供试品溶液与对照液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、48 h 进样，考察稳定性。结果：对照溶液48 h 内主峰峰面积的RSD 为0.63%；供试品溶液48 h 内均只检出异构体C，其含量的RSD 为0.0%。表明替格瑞洛供试品溶液与对照液在室温条件下放置，在至少48 h内稳定。

2.4.9 耐用性

按照2.2 项下配制空白溶液、替格瑞洛供试品溶液、对照液及系统适用性溶液，微小改变色谱条件，按照2.1 项下色谱方法检测，考察耐用性。各个测试条件下，空白溶剂对待测组分均无干扰，结果见表1。

表1 耐用性考察结果Tab.1 Durability test results

结果表明：微小改变流速、柱温、流动相初始比例、使用不同批次色谱柱，不会对检测结果造成影响，方法的耐用性良好。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法测定替格瑞洛原料药中各异构体含量的方法。该方法能准确检测替格瑞洛原料药中替格瑞洛对映异构体A和其他非对映异构体杂质B、C、D、E，且方法灵敏度高，精密度好，能够满足替格瑞洛原料药商业化生产中各异构体含量的检测要求，更好地控制产品的质量。