致羔羊腹泻沙门菌的分离鉴定及耐药性检测

刘蒙恩，刘 洋，左春生

(1.河南省叶县中等专业学校，河南 叶县 467200；2.新乡医学院口腔医学院，河南 新乡 453003 ；3.信阳农林学院动物科技学院，河南 信阳 464000)

沙门菌是临床主要的食物源病原菌之一，该菌具有广泛的宿主性，可以感染多种动物及人，引起动物和人发病的沙门菌的血清型目前有2 523个，该菌感染主要引起多种动物的败血症、肠胃炎和流产等，其感染率和死亡率均较高[1-3]。沙门菌可以在运输中的动物和未煮熟的动物食品间传播，对人的危害也较大，已成为公共卫生研究的热点问题[4-5]。羊沙门菌病主要由鼠伤寒沙门菌、都柏林沙门菌、羊流产沙门菌等不同血清型的沙门菌引起。沙门菌可以感染不同阶段、不同品种的羊，其中断奶或断奶不久的羊较新生羔羊易感，且以血性下痢为主要临床症状，其死亡率可达60%以上[6-7]。因此，养殖场应注重该病的防治。目前，临床中应用抗生素是控制沙门菌感染的主要手段之一，但随着抗生素的滥用，沙门菌的耐药现象也日趋严重，且产生多重耐药菌菌株，对该菌的防控带来一定的困难，同时可导致肉产品中的药物残留，危害人类的身体健康[8-11]。因此，对沙门菌的合理防控具有重要的公共卫生学意义。

本试验于2018—2020年采集信阳地区不同养殖场中患腹泻羔羊的肛拭子、粪便等病料组织274份，进行沙门菌的分离鉴定，并检测分离菌株的致病性、耐药表型和耐药基因的携带情况，以期为该地区养殖场中致羔羊腹泻沙门菌的综合防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2018—2020年采集自河南省信阳地区不同养殖场中患腹泻羔羊的肛拭子、粪便等病料组织274份。

1.2 主要试剂 沙门菌增菌液(TTB)、沙门菌显色鉴定培养基、营养肉汤，均购自广东环凯微生物科技有限公司；32E肠杆科菌生化鉴定试纸条，购自法国生物梅里埃公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DL2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 实验动物 675只昆明系小鼠，体重约22 g，由信阳农林学院动物科技学院实验动物中心饲养。

1.4 细菌分离培养与初步鉴定 将采集的样品进行处理后接种于TTB，37 ℃震荡培养8～12 h，增菌后接种于沙门菌显色鉴定培养基，37 ℃恒温培养12～18 h后，挑单菌落纯化培养，革兰染色显微镜下观察其形态学特征。取纯化的分离菌株，按照说明书调整浓度进行生化鉴定试验。

1.5 细菌PCR鉴定 参照参考文献[12]，根据GenBank中沙门菌基因序列，设计沙门菌保守区引物invA(5′-ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT-3′；5′-AGACGACTGGTACTGATCGATAAT-3′),引物扩增片段大小为244 bp，引物由深圳华大基因股份有限公司合成。采用细菌基因组DNA试剂盒制备DNA模板，进行PCR鉴定。回收PCR产物送华大基因测序，其测序结果与GenBank中登录的沙门菌参考株进行同源性比对鉴定。

1.6 致病性试验 将分离菌株培养至对数期，菌落计数，每株分离菌株灌胃攻毒组5只小鼠，剂量为0.25 mL(107CFU/mL)，对照组灌胃等量的无菌肉汤，观察6 d，记录小鼠的发病和死亡情况。

1.7 药敏试验 药敏试验参照美国临床实验室标准委员会(CLSI)2019年推荐的标准K-B纸片法进行操作和判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)，分析分离菌株的耐药性。

1.8 耐药基因的检测 参照参考文献[13]，根据GenBank中登录的沙门菌耐药基因序列：β-内酰胺类耐药基因(tem、cmy、shv)，磺胺类耐药基因(sul1、sul2、sul3)，氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib]，喹诺酮类耐药基因[gyr(A)、gyr(B)、qur(S)]，四环素类耐药基因[tet(A)、tet(M)、tet(R)]，酰胺醇类耐药基因[flo(R)]，多肽类耐药基因(mcr-1)，用Primer 5.0设计引物，并由华大基因合成引物，对上述7类耐药基因进行PCR扩增检测。

2 结果

2.1 细菌分离培养与初步鉴定 在沙门菌显色培养基上长出边缘整齐、大小一致、蓝紫色的菌落，染色镜检可见无荚膜、两端钝圆的阴性短杆菌，通过生化试验初步鉴定为沙门菌，共有134株。

2.2 细菌PCR鉴定 对初步鉴定的134株沙门菌，用沙门菌特异性引物invA进行PCR鉴定，结果显示，134株沙门菌均扩增出大约为244 bp的目的条带(图1)，且134株分离菌的测序结果与GenBank中登录的沙门菌参考株同源性均在97.9%以上，从分子生物水平说明分离菌株为沙门菌。

图1 细菌PCR鉴定

2.3 致病性试验 攻毒组的小鼠出现精神沉郁、采食量减少、寒颤，个别出现腹泻，有的未表现出临床症状即出现急性死亡，对照组小鼠至试验结束未出现发病和死亡情况。从发病死亡的小鼠体内分离得到沙门菌，经统计102株沙门菌能引起小鼠发病。

2.4 耐药性分析 抗生素敏感性试验结果如表1所示，分离的102株沙门菌对氨苄西林、庆大霉素、新霉素、大观霉素、多西环素、土霉素、多黏菌素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噁唑啉、磺胺间甲氧嘧啶10种药物的耐药性比较严重，耐药率在70.6%～100%。对头孢噻肟、头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考、氧氟沙星、环丙沙星6种药物的耐药率较低，耐药率在8.8%～31.3%。说明该地分离的沙门菌耐药性严重。如表2所示，临床中分离的102株沙门菌呈现多重耐药性，耐16、6种药物各有6株，耐 15、14、9种药物各有7株，耐7种药物有5株，耐12、11、10种药物分离菌株最多，分别占分离菌株的15.7%、16.7%和14.7%。

表1 耐药性检测结果

表2 多重耐药性检测结果

2.5 耐药基因检测 分离的沙门菌对7类药物的16种耐药基因的PCR检测结果见表3，分离的102株沙门菌共携带16种耐药基因；其中耐药基因sul1、sul2、sul3、aac(3)-Iv、aac(6′)-Ib、tet(A)、tet(M)、tet(R)、mcr-1检出率为61.4%～100%；耐药基因tem、cmy、shv、gyr(A)、gyr(B)、qur(S)、flo(R)检出率为4.9%～20.6%。说明分离的沙门菌携带多种耐药基因。

表3 耐药基因检测结果

3 讨论

沙门菌具有多种血清型，可以感染多种动物和人类，并且该菌传播途径较广泛，易引发食物中毒和败血症等，成为临床重要的人兽共患病病原之一[14-15]。随着肉羊养殖数量的增加，关于羊的沙门菌病报道逐渐增多，且对羔羊危害较严重。许多研究表明，沙门菌具有多种血清型且发病具有地区性，给疫苗研制带来一定困难，也是导致其广泛流行的重要因素之一[9-11]。因此，相关部门应该重视沙门菌病的综合防控。本试验于2018—2020年采集信阳地区不同养殖场中患腹泻羔羊的肛拭子、粪便等病料组织274份，从中分离得到102株致病性沙门菌，说明该区的养殖场中致羔羊腹泻沙门菌感染严重，存在一定的潜在威胁，应该注意该病的综合防控。

国内许多研究表明，从猪场、鸡场分离的沙门菌具有很强的耐药性，呈现多重耐药性[16-17]。国内关于致羔羊腹泻沙门菌耐药性的报道较少。本试验表明，分离的102株沙门菌对常用的抗生素产生了很强的耐药性，对氨苄西林、庆大霉素、新霉素等10种药物的耐药率介于70.6%～100.0%，对其他药物的耐药率介于8.8%～31.3%。说明沙门菌耐药性是普遍存在的，在临床中应该注意抗生素的合理使用。研究表明，沙门菌耐药性的产生与抗生素的使用有关，还与携带的耐药基因有关，耐药基因可以通过多种途径在动物和人类之间传播，对人类健康造成隐患[18-19]。本试验结果表明，分离的102株沙门菌共携带16种耐药基因，尤其对磺胺类和四环素类耐药基因检出率较高，携带耐药基因型是否是引起耐药性的主要因素，有待进一步研究。本试验结果为该地区的致羔羊腹泻沙门菌的综合防控提供了数据支持。