牛羊芽囊原虫病研究进展

周天政，居融程，黄尚选，覃建基，肖华春，李军成，李凤梅，彭健波

(1. 广西农业职业技术大学，广西 南宁 530007；2. 田阳尚选畜牧养殖有限责任公司，广西 百色 542899)

芽囊原虫(Blastocystis)是一种厌氧单核细胞寄生虫，曾长期被认为是一种无害的酵母，但越来越多的研究表明芽囊原虫广泛存在于牛羊肠道内，对牛羊健康造成威胁，同时携带可感染人类的亚型基因，具有一定的公共卫生风险。本文通过对国内外牛羊感染芽囊原虫的相关研究报道进行分析，从牛羊感染芽囊原虫的病原学、基因型、流行病学、致病性、诊断与防治等方面进行综述，以期为其他动物甚至人类的芽囊原虫病的预防和控制提供参考。

1 病原学

芽囊原虫的生物学分类几经波折，曾先后被认为是酵母菌、真菌、鞭毛虫等。1912年首先由Brumpt进行分离，并命名为肠道酵母菌[1]。1967年，Zierdt根据形态学、生理学特点，发现其符合原生生物的特征[2]；1988年，Zierdt发现该生物有一个或多个核、光滑粗糙的内质网、高尔基复合体和线粒体样细胞器；但它不能在真菌培养基上生长，也不能被抗真菌药物杀死，因此排除真菌的假设[3]。1996年，Silberman等通过与真核生物谱系的部分同源编码区进行测序对比，建议将其归为不等鞭毛门、芽囊原虫纲、芽囊原虫目、芽囊原虫科、芽囊原虫属[4]。1998年，Cavalier-Smith通过分子系统学研究发现，芽囊原虫与鞭毛虫原单胞菌有系统发育关系，两者存在某些共同的生命周期特征，作为脊椎动物的肠道内共生体似乎可以在宿主之间传播。但与原单胞菌不同的是，囊虫没有鞭毛，因此Cavalier-Smith建议把它归于一个新创建的类囊虫亚门[5]。近年来随着分子生物学、酶系统等技术发展，虫体新的特征被发现，使其分类学逐步确定下来。

芽囊原虫体积小，但形态结构多样化，表现出包括空泡、颗粒、阿米巴、包囊等形态，不同类型形态大小有所差异(图1)。空泡型呈球形，其特征是一个大的空泡，空泡可占细胞体积的90%，在大小上变化很大，直径为2～200 μm，平均直径为4～15 μm。颗粒型被认为是由空泡型和其他因素引起的。这些因素包括培养基种类，培养基中的血清浓度以及某些抗菌剂，如抗原虫药硝基咪唑类药物可抑制芽囊原虫生长从而影响其形态，而其他驱虫药、抗真菌和抗菌药物氨苄青霉素、链霉素和庆大霉素等不会对芽囊原虫的形态产生影响。颗粒型与空泡型有许多相似之处，除了颗粒型在周围胞质或中央液泡内存在着大量的颗粒，这些颗粒由形态差异的包涵体、结晶和脂滴颗粒等组成。阿米巴型相对较小(直径为2.6～7.8 μm)，并具有延伸的伪足，曾被认为是空泡型和包囊型之间的中间体。包囊型体积小(直径为3～5 μm)，呈球形到卵形，并由多层囊壁保护，具有较强的抵抗性，能耐受胃液，可在自然外界环境中存活，被认为是芽囊原虫在体外传播的主要类型。在常规粪便检查或体外培养中常见空泡型，其次是颗粒型。

图1 芽囊原虫模式图

芽囊原虫具有二元分裂生殖、出芽生殖、裂殖生殖等多种繁殖方式，其中二元分裂生殖最为常见[6]。已有学者根据其不同类型的分化特点对它的生命周期进行了探索[7]。体外试验结果表明，芽囊原虫包囊型在培养基中24 h内可发展成空泡型或颗粒型：在1 h时，包囊壁明显增厚；在3 h时，包囊内出现有多个小液泡，其中包含许多内容物，聚集在细胞质中；在6 h左右时，包囊壁被一层厚厚的包膜取代；在9 h时，胞体由最初的5 μm扩大到7～9 μm，同时包囊内的多个小空泡在细胞中央区域聚集，最终合并形成中央空泡，这样空泡内包涵体沉积到中央液泡中，形成颗粒型；在12 h时，虫体仍被包囊壁包围，但在内部可观察到二元分裂形成的多个子细胞，以及明显的空泡和颗粒状；在24 h时，细胞表面及包囊壁脱落，完成细胞分化[8]。一般认为临床上芽囊原虫以经口或粪—口传播为主，牛羊等动物经口摄入包囊型虫体后，虫体在大肠中被激活，并发展成空泡型，最终沉积在粪便排出，但详细过程仍需要动物试验进一步证实。

2 基因型

芽囊原虫遗传基因具有多样性，主要表现为其小亚基核糖体RNA基因(Small subunit rRNA gene,SSU rRNA)的核苷酸多态性，2013年报道了17个经典亚型(ST1～ST17)，随后新的亚型不断被发现，目前文献中已有ST32的相关报道。不同的基因亚型表现出不同的宿主特异性、地区差异性。宿主特异性方面，人芽囊原虫相关研究较多，目前已确认能感染人的基因亚型主要有10种，分别为ST1～ST9和ST12，我国人群芽囊原虫基因亚型以ST1～ST3为主，各省市的感染率中以贵州(5.69%)、广西(4.52%)较高[9]。而牛羊等反刍动物感染芽囊原虫的基因亚型主要有ST1、ST3、ST4、ST5、ST6、ST10、ST14共7种，在我国云南[10-11]、河南[9，12]、陕西[9，13]、青海[9]、吉林[9]等地的牛羊检出人兽共患的基因型有ST1、ST3、ST4和ST5，表明牛羊等反刍动物可携带危害人类的基因型，需要警惕公共卫生风险。在地区差异性方面，中国、英国、意大利、伊朗、马来西亚等国家和地区牛羊感染芽囊原虫主要基因型有ST10、ST14，其中优势基因亚型均为ST10，但也有个别地区或国家有所不同，如美国优势基因亚型为ST5，而哥伦比亚优势基因亚型为ST1。我国不同省份检出的基因型也有会有差异，如云南牛中检出ST1、ST5、ST10、ST14这4种基因型[9]，而河南奶牛则可检出ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14这6种基因型[12]。不同年龄阶段的易感亚型不同，梁霞霞等[10]发现成年牛ST10的感染率(80.32%)高于犊牛(74.47%)。而王莎莎[13]研究发现，秦川牛和奶牛感染芽囊原虫主要分布于断奶前犊牛。

3 流行病学

牛羊芽囊原虫在美国、英国、意大利、印度尼西亚等多个国家以及我国的陕西、河南、云南、广东等地均有报道。从世界范围来看，经济发达、卫生状况较为良好的地区呈现较低的感染率，相反的则有较高的感染率，如意大利为17.82%[14]，印度尼西亚为100%[15]。这些差异性可能与“粪—口”传播方式有关，粪便排放及管理不良可成为重要的感染来源。从我国不同区域来看，发病率呈现南北方低而西北西南地区高的趋势。东北地区(黑龙江)芽囊原虫感染率为10%左右[16-17]；而西北地区(青海、陕西)则为25%左右[13,18]；西南地区(云南)为27.62%[10]；中原地区(河南)为19.2%[12]；南方地区(广东)为1.88%[19]。

在其他影响因素中，发育阶段、性别、季节是主要因素。发育阶段方面，牛芽囊原虫的感染率随着年龄的增长呈现先增长再降低的趋势[19]。犊牛断奶后感染率(38.6%)明显高于断奶前的感染率(13.0%)[13]，而犊牛的感染率(47.00%)显著高于成年牛(20.96%)[20]；从具体月龄来看，Zhu等[16]发现3～12月龄(36.1%)牛的感染率明显高于3月龄以内牛(18.8%)；Lee等[21]也发现3～12月龄牛的感染率(20.8%)显著高于成年牛(7.2%)及3月龄以下的犊牛(4.0%)。断奶应激造成的免疫力低下可能是牛芽囊原虫感染率升高的重要因素。而羊芽囊原虫的感染率也有类似的变化趋势。黑山羊以1～2岁的感染率最高(50.9%)，1岁以下及2岁以上黑山羊的感染率均呈下降趋势[11]。而奶山羊、绒山羊则在7～11 月龄时感染率达到最高(66.5%)[22]。性别方面，牛羊芽囊原虫病中雄性比雌性更易感。梁霞霞等[10]调查发现，云南省云岭牛雄性的感染率(37.66%)显著高于雌性的感染率(25.16%)。而谢世臣[11]研究发现，山羊也有相同的趋势，雄性感染率(45.0%)显著高于雌性(32.9%)；上述研究结果提示芽囊原虫的感染可能受到激素的影响，但不同性别在各年龄阶段中的差异性仍需要研究证实。季节方面，夏季芽囊原虫的检出率高于其他季节[17，18，23]，高温高湿季节可能适合芽囊原虫的生长繁殖；但庄尔俊等[24]发现，云南独龙牛在冬季的感染率最高，提示芽囊原虫流行病学受多种因素的影响，需要更多临床试验进行证实。芽囊原虫的感染还可能与动物品种、粪便形态及肠道pH等因素有关。

4 致病性

目前，芽囊原虫的致病性仍存在一定的争议，可能与感染的基因型、动物种类等相关。芽囊原虫的致病性在人体得到体现，流行病学调查显示，免疫功能低下的人更容易被芽囊原虫感染。而芽囊原虫的阿米巴型因能排泄蛋白酶，被认为最具危害性，其主要在有症状患者的粪便标本中被发现[25]。体外及动物模型研究表明芽囊原虫因蛋白酶、水解酶等活性，具有潜在的致病性。其中半胱氨酸蛋白酶作为毒力因子可引起细胞骨架的变化促进细胞凋亡，造成肠道通透性增加；诱导黏膜细胞产生白细胞介素-8，造成患者及动物液体流失和肠道炎症；半胱氨酸蛋白酶还可裂解IgA，从而影响免疫系统[25]。另外质谱分析鉴定了芽囊原虫分泌产物中的20种半胱氨酸蛋白酶、1种丝氨酸蛋白酶和1种天冬氨酸蛋白酶，这些蛋白酶在破坏肠道功能中有重要作用[26]。水解酶能破坏宿主组织，影响宿主肠道微生物群，使人出现腹泻、腹痛和呕吐等胃肠道反应、荨麻疹等皮肤症状[27]。在大鼠等动物建立的芽囊原虫感染模型也发现回肠和盲肠部位有充血、水肿、细胞黏膜脱落及炎症细胞浸润固有层等病理变化[21]。随着研究的深入，发现芽囊原虫的致病性存在种属差异性，基因型上也会有差别。如ST4和ST7亚型的半胱氨酸蛋白酶活性存在显著差异，与ST4亚型相比，ST7亚型更能诱导肠道上皮通透性增加[28]。但目前没有牛羊感染芽囊原虫病后相关症状或病变的报道，因此牛羊芽囊原虫病的影响更多体现在公共卫生方面，澳大利亚的研究显示ST5亚型在养殖场工人中普遍存在[29]，提醒牛羊饲养人员面临较高的感染风险。

5 诊断与防治

牛羊芽囊原虫病的诊断方式一般有临床诊断和实验室诊断2种。芽囊原虫寄生于人体的回盲部，平时并无明显症状，但当人体免疫功能低下时虫体大量繁殖，可出现腹痛、腹泻、胃肠胀气等消化道症状；而目前牛羊感染症状的报道很少，因此难以从临床症状进行诊断，其诊断方式以实验室诊断为主，主要有显微镜检查、实验室培养、血清学检查、分子生物学等。(1)显微镜检查法，该方法操作简单，但因芽囊原虫形态较小且具有多样性，加上粪便样品中常含有大量脂质内含物和糖原沉积，造成芽囊原虫在显微镜观察中容易与脂质体等其他物质混淆，影响病原鉴定，该方法目前在临床中应用少。(2)实验室培养法，通过培养菌株而确诊，但其对培养条件有严格要求且培养时间较长，检测效率并不高。(3)血清学检查法，该方法具有较高特异性，但因芽囊原虫引起免疫应答的抗体效价不高，且不能区分感染的亚型，这也限制该方法的应用。(4)分子生物学法，该方法是当前诊断芽囊原虫的主要方法，主要有PCR、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。其中基于 SSU rRNA基因检测和分析的PCR 检测是一种快捷、高效和敏感的检测方法，目前已广泛应用于芽囊原虫的检测。SSU rRNA 基因序列可以作为芽囊原虫不同亚型基因序列的标记，有利于对芽囊原虫亚型进行统一命名。而LAMP是Notomi等[30]在2000年建立的，具有对实验设施要求不高、检测灵敏度和特异性高等优势，更适合在偏远地区使用。我国王品雪等[31]优化LAMP的反应体系和反应条件，用于检测牦牛芽囊原虫，发现LAMP有较高特异性，且敏感性和重复性优于PCR。

诊断技术的发展为疾病开展针对性预防和治疗打下基础，鉴于芽囊原虫的粪—口传播方式，做好牛羊粪便管理和环境卫生工作将是预防芽囊原虫病的重要方式。平时饲养管理中应及时处理栏舍的粪便，通过堆积发酵等措施杀灭虫体，同时保持栏舍干燥通风，创造不利于虫体存活的环境，定期进行栏舍及周边环境消毒，杀灭其中的虫体。牛羊感染芽囊原虫后能提供治疗的药物不多，甲硝唑是治疗人芽囊原虫的首选药物，但该药已禁用于食品动物。一些化学药品如复方新诺明、巴龙霉素等及中药提取物如石榴根皮(100 μg/mL)[32]、青蒿乙醇提取物(2 000 μg/mL)[33]体外均可抑杀芽囊原虫，在治疗牛羊芽囊原虫病时可供参考。

6 展望

牛羊芽囊原虫的感染情况在世界多个国家均有研究报道，表明它是感染牛羊的重要寄生虫之一。牛羊芽囊原虫感染呈现出地区、年龄、性别、品种等方面的差异性，以及牛羊所携带的ST1、ST3基因亚型与我国人群常见的感染亚型重叠，提示需要防范芽囊原虫可能造成的公共卫生安全风险。截至目前为止，有关牛羊芽囊原虫的生活史、致病性、临床表现等方面，特别是牛羊的优势基因亚型ST10的致病特点需要深入开展研究，为后续牛羊芽囊原虫病的防控提供理论依据。