α-Klotho保护移植肾功能的研究进展

张爱华 朱一辰 综述 刘文虎 审校

Klotho基因最初被认为是一种抗衰老基因[1],对其所编码蛋白质的种类、结构和功能等研究的深入,发现Klotho蛋白具有多种生物学功能。目前研究最多且相对较为清楚的是α-Klotho亚型,其主要表达于近端肾小管上皮细胞[2-3],存在膜型和可溶型两种形式。膜型作为成纤维细胞生长因子23(FGF-23)的共受体,参与调节整个机体或肾脏局部钙、磷及维生素D的代谢[4];可溶型可由膜型胞外段裂解而来,也可直接由mRNA剪切合成[5],既能以自分泌和(或)旁分泌的形式调节肾脏局部的炎症反应、氧化应激及凋亡等[6],也可随血液循环到达远隔部位发挥组织器官保护作用[7]。

移植肾功能延迟恢复(DGF)及慢性移植肾功能不全是影响移植肾器官生存和受者预后的重要因素[8-9]。肾小管的缺血-再灌注损伤(IRI)和各种形式的排斥反应在其中扮演了关键性角色[10]。作为主要表达在肾脏的抗老化、抗炎、抗氧化应激、抗凋亡分子,Klotho也通过多种作用形式参与其中,已有研究者开始尝试探索干预Klotho对移植肾的保护作用。

α-Klotho蛋白的结构和功能

人Klotho基因位于13号染色体(13q12)[5],由5个外显子和4个内含子构成,可编码α、β和γ三种Klotho蛋白,最主要的为α-Klotho。膜型α-Klotho是含有1 014个氨基酸残基的Ⅰ型跨膜糖蛋白[1],胞外段含有两个独立的糖基水解酶结构域(KL1和KL2),是α-Klotho活性和功能的主要承载者;跨膜结构域含20个氨基酸残基。胞内段较短,仅由9个氨基酸残基组成。膜型主要存于肾脏和脑脉络丛[6],如前述,肾脏主要表达在近端肾小管上皮细胞,是FGF-23的共受体。可溶型α-Klotho游离存在于血液、尿液、脑脊液等体液中,有裂解型和分泌型两种形式。裂解型源自膜型胞外段的裂解。依据裂解部位的不同,有两种不同的分子量。长裂解型由去整合素金属蛋白酶10和17(ADAM10和ADAM17)裂解而成,KL1和KL2均包含在内,分子量约130 kD;短裂解型由β淀粉样蛋白分泌酶(BACE1)裂解而成,仅含KL1,分子量约65 kD。分泌型α-Klotho则是由细胞直接分泌,是在转录水平即拼接为不同的mRNA,直接翻译成仅含KL1的蛋白质,是可溶型α-Klotho的主要来源。虽然分子量与短裂解型相当,但C末端的氨基酸序列并不完全相同[5]。可溶型α-Klotho具有卓越的抗氧化、抗炎症、抗凋亡能力,但此三种之间的是否有所差异尚不清楚。这四种形式的α-Klotho蛋白的结构示意图见图1。

α-Klotho与移植肾功能相关的临床证据

基于α-Klotho定位及生物学功能的上述特性,肾移植领域对其的关注度越来越高。Kimura等[11]检测了肾移植受者手术前后尿液中的可溶型α-Klotho,发现受者移植前24 h尿α-Klotho水平仅为活体供者的十分之一,术后第2天即明显增高,至第5天基本与正常供者相当。Thongprayoon 等[12]对2019年10月后的研究进行了Meta分析,共10个队列431例受者，发现移植后受者血清α-Klotho水平显著增高,且与其估算的肾小球滤过率(eGFR)相匹配。Shikida等[13]进一步回顾性分析了41例活体供肾受者,发现移植前血清可溶型α-Klotho的水平低者在术后3月内更容易出现eGFR的显著下降(下降≥30%)。

这些研究仅分析了可溶型α-Klotho,未涉及肾组织局部的α-Klotho;且测定值有的来自于供者,有的来自于受者,有的是受者和供者的混合。为此,Kim等[14]特定评价了供者血液和肾组织中α-Klotho水平对移植肾功能的预测价值，研究入选了60例尸体肾移植受者。在获取供肾前留取供者血标本;在植入受者即刻行供肾肾活检。根据供肾α-Klotho的表达水平将受者分为两组,结果显示高表达组术后1周eGFR的改善显著优于低表达组[63.9±28.2 mL/(min·1.73 m2)vs47.5 ± 21.9 mL/(min·1.73 m2),P=0.030],提示供肾α-Klotho的水平与移植后肾功能的早期恢复密切相关。根据供体血清可溶型α-Klotho分组的组间比较初步分析未见统计学差异;但在排除了活检证实的急性排斥反应后,α-Klotho的有益作用得以彰显,血清α-Klotho高的供者其受者在术后12月时eGFR显著更高[67.5±14.5 mL/(min·1.73 m2)vs53.5±10.8 mL/(min·1.73 m2),P=0.043]。因此，该研究者认为供者α-Klotho是尸肾预后的重要预测因子。这一推测符合肾移植的具体病情,毕竟进入终末期肾病后,原肾本身的α-Klotho产生非常有限。

Pazik等[15]进一步分析了170例尸体肾供者Klotho基因型对移植后早期移植肾形态和功能的影响。主要关注了Klotho基因rs9536314的多态性。结果显示G等位基因携带者(GG型或GT型)第3个月蛋白尿发生率明显高于TT单倍型(24.4%vs9.5%,P=0.030,OR=3.09，95%CI 1.22～7.69);第3个月GFR中位数显著低于TT型[35.0(20.4～76.6) mL/(min·1.73 m2)vs46.3(15.5～96.8) mL/(min·1.73 m2),P=0.001]。

α-Klotho改善移植肾功能的机制研究

尽管临床证据极大推动了相关机制的研究,但由于肾移植动物模型建立困难及其对供肾时效性的较高要求(包括尽可能短的热缺血和冷缺血时间),目前的证据多来自体外实验或单纯缺血再灌注模型。

α-Klotho减轻IRICastellano等[2]发现，IRI发生24 h后,猪肾组织中的α-Klotho显著降低。Panah等[16]则揭示α-Klotho mRNA的下调在IRI后3 h即已开始,可持续3～4 d之久;并推测α-Klotho可稳定核因子κB(NF-κB)异二聚体p50/p65与核抑制因子κB(IκB)形成的复合物,从而抑制移植肾IRI时炎症因子和氧化应激的高度活化,阻断急性肾损伤(AKI)的发生。α-Klotho缺乏也与移植肾受者内皮功能障碍有关[17]。Zhang等[18]评估了肾小管上皮细胞的上皮-间充质转分化(EMT),证实α-Klotho能经由Wnt/β-Catenin信号通路抑制EMT,减轻移植功能障碍的发生发展。Li等[19]进一步在动物水平验证了上述结果。他们从C57BL/6小鼠中分离出骨髓间充质干细胞(BMSCs),转染Klotho-GFP腺病毒,再将其移植到AKI小鼠体内,发现Klotho-GFP-BMSCs移植小鼠IRI后的肾纤维化程度显著低于假手术组,并再次证实是通过抑制肾小管上皮细胞的Wnt/β-catenin通路实现的。

α-Klotho减轻排斥反应α-Klotho也被报道可减轻排斥反应。急性血管性排斥以内皮细胞激活和损伤为特征,而α-Klotho对内皮细胞具有抗凋亡、抗炎作用,并能增强其对活性氧簇的抵抗力。Liu等[20]将猪内皮细胞与α-Klotho预孵育,然后暴露于异种反应性抗体和补体。实时荧光定量PCR显示α-Klotho能抑制抗体诱导的VCAM-1和IL-1等促炎基因的表达和NF-κB的激活、减弱IκBα的磷酸化。此外,α-Klotho还诱导了猪内皮细胞对补体依赖性细胞毒的抗性,IgG和IgM异种反应性抗体与猪内皮细胞的结合降低,抗炎基因血红素加氧酶1(HO-1)的表达上调。

增加移植肾α-Klotho表达的措施

早在2011年,Tataranni等[21]就发现雷帕霉素可在一种永生近端肾小管上皮细胞系中诱导Klotho的表达。Mizusaki等[22]进一步招募了36例肾移植受者,发现口服依维莫司的患者血清可溶型α-Klotho水平显著高于未口服者(536.7 pg/mLvs332.4 pg/mL,P=0.026),提示抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)有增加肾移植受者血清可溶型α-Klotho的作用,可能不失为保护移植肾功能的手段之一。

Castellano等[2]在猪IRI膜型中观察到补体C1的抑制剂可通过NF-κB信号通路改善肾脏局部α-Klotho的表达。而体外实验则显示，补体C5a可显著下调肾小管上皮细胞α-Klotho的mRNA水平。依库珠单抗是靶向于补体C5的人源化单克隆抗体,抑制C5裂解为C5a和C5b,已被批准应用于阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)和非典型溶血尿毒综合征(aHUS)的治疗[23-24],也许不久的将来也能用来防治DGF,实际上其对肾移植抗体介导排斥反应治疗的有效性和安全性已经在逐步评价中[25]。

Leone等[26]的研究则提示重组人红细胞生成素(rhEPO)也对移植肾受者的可溶型α-Klotho有调节作用。停用rhEPO 5周后,肾移植受者血清α-Klotho水平显著降低。在人肾小管上皮细胞中,rhEPO预处理可减轻环孢素所致的Klotho下调。

综上所述,高水平的α-Klotho与移植肾功能改善密切相关,可能与其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纤维化和抗排斥等多种生物学作用有关。上调移植肾受者α-Klotho的表达可能是促进移植肾功能早期恢复、减少慢性肾功能不全发生发展的非常有前景的干预靶点之一。