戊型肝炎病毒感染对补体系统表达的影响

王文静，王珏，禹文海，姜典财，黄芬

1. 昆明理工大学医学院，云南昆明650500；2. 中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650038；3. 大连雅立峰生物制药有限公司，辽宁 大连 116000

补体是由肝细胞、巨噬细胞等多种细胞产生的，参与免疫效应的一类大分子蛋白质，是由30 多种可溶性蛋白、膜结合蛋白和补体受体组成的多分子系统。按照生物学功能的不同，补体可分为3 种组分：第一类为固有成分，由11 种球蛋白组成（如C1 ~C9 等）；第二类为调控蛋白，以可溶性膜结合形式参与补体活化（如CD55 和CD59 等）；第三类为补体受体，可识别配体，进行信号传导等（如C5aR 和C3aR等）［1-2］。补体系统可选择性识别和清除病原体，在机体先天免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，是机体抵抗病毒感染的第一道防线。当补体组分含量出现异常时，会增加机体对疾病的易感性，导致机体组织器官损伤［3］。如在胰腺癌患者血清中发现了补体C3 和C4 的大量沉积［4］；在神经性红斑狼疮患者体内检测到 C3、C4 和 CD59 的大量消耗［5-6］；在阵发性夜间血红蛋白尿和再生性贫血等患者中均检测到调节蛋白CD55 表达异常［7］。因此，推断补体可能参与了宿主的自身免疫调节。

肝炎病毒的复制与补体的激活有关，如慢性乙型肝炎及丙型肝炎患者中C3 和C4 含量相对于正常人明显降低；慢性丙型肝炎患者中发现CD59 含量增多［8-9］。因此，补体的激活在病毒入侵机体的过程中发挥重要作用。然而目前对于戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）复制过程中补体的研究较少，在HEV 感染过程中补体激活调控的信号通路尚不清楚。

HEV 是一种危害人类健康的病毒性肝炎病原体［10］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据显示，全球每年约有2 000 万人感染HEV，其中7 万人死亡，在孕妇中致死率高达25%［11］。戊型肝炎早期被认为是一种急性自限性疾病，孕妇（尤其是妊娠晚期）感染HEV 后容易造成胎儿早产、流产和死胎［12］。在感染HEV 的孕妇中发现孕期雌激素和孕激素水平明显升高，孕期激素水平与HEV 的病毒滴度有一定相关性［13］，这可能导致孕妇在妊娠晚期更易感染HEV。为了解HEV 感染孕妇后对补体系统的调控作用，探究补体C3、C4、C3aR、CD55和CD59 在HEV 感染孕妇中的变化，本研究采用免疫比浊法检测HEV 感染的孕妇及非孕妇患者血清中的补体固有成分C3 及C4 的表达水平，RT-qPCR法检测HEV 患者全血中补体C3aR、CD55 和CD59的表达水平，从而探讨感染HEV 的孕妇和非孕妇患者中补体水平的变化。

1 材料与方法

1. 1 研究对象 收集云南省昆明市妇幼保健院HEV 感染孕妇（n = 20）及非孕妇全血样本（n = 20），置-80 ℃冰箱保存备用。研究对象均排除甲肝、乙肝、丙肝和丁肝等肝炎病毒感染。

1. 2 主要试剂及仪器 Trizol 试剂购自美国Axygen公司；RNAiso Plus、逆转录酶（Rtase M-MLV）、RNA酶抑制剂、RT-qPCR 试剂（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）均购自宝生物工程（大连）有限公司；免疫比浊法检测试剂和Array 360 特种蛋白分析仪均购自美国Beckman 公司。

1. 3 HEV 感染孕妇及非孕妇患者血清中补体固有成分C3 及C4 水平的检测 采用免疫比浊法。取HEV 阳性患者血清，采用Array 360 特种蛋白分析仪检测血清样本中补体C3、C4 水平，具体操作按试剂盒说明书进行。人血清中补体C3 的正常范围为 0. 7 ~ 1. 28 g ／ L，补体 C4 的正常范围为 0. 17 ~0. 48 g ／ L。

1. 4 HEV 感染孕妇及非孕妇患者全血中HEV 滴度及补体C3aR、CD55 和CD59 表达水平的检测 采用RT-qPCR 法。用Trizol 试剂提取全血中总RNA，用MLV 逆转录试剂盒及HEV 特异性引物（引物序列见表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成）进行逆转录，以合成的cDNA 为模板进行RT-qPCR。反应体系：cDNA 样品 1 μL，上下游引物各 0. 2 μL，2 ×ChamQ SYBR Color qPCR Mix 5 μL，添加无菌无酶水至 10 μL。反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃31 s，共 39 个循环；溶解曲线形成，65 ℃升至 95 ℃，每5 s 升高0.5 ℃，阴性对照排除PCR 污染。对HEV滴度进行绝对定量分析，按2-（目的基因△Ct-GAPDH△C）t对目的基因C3aR、CD55 和CD59 进行相对定量。

表1 PCR 扩增引物序列Tab. 1 Primer sequences for PCR amplification

1. 5 统计学分析 使用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，应用t 检验确定两组间差异的显著性，以P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 HEV 滴度 与非孕妇患者相比，孕妇患者全血中HEV 的拷贝数变化显著，差异有统计学意义（t =7. 006，P < 0. 001），见图 1。表明 HEV 感染孕妇后促进病毒的复制。

图1 孕妇及非孕妇患者中HEV 滴度Fig. 1 HEV titers in pregnant and non-pregnant women

2. 2 血清中补体固有成分C3 及C4 水平 孕妇患者血清中补体C3 水平为0. 95 ~ 1. 63 g ／ L，显著高于非孕妇患者血清中补体 C3 水平（0. 09~1. 58 g ／ L），差异有统计学意义（t = 35. 41，P < 0. 001），表明HEV感染激活患者血清中C3 的表达。孕妇患者血清中补体 C4 水平为 0. 04 ~ 0. 435 g ／ L，高于非孕妇患者血清中补体 C4 水平（0. 005 ~ 0. 336 g ／ L），差异有统计学意义（t = 5. 538，P < 0. 05），但大部分患者血清中C3、C4 水平均在正常值范围内，表明HEV 感染对补体C4 水平无明显影响。见图2。

图2 HEV 感染孕妇及非孕妇血清中补体固有成分C3（A）及 C4（B）水平的检测Fig. 2 Expression levels of C3（A）and C4（B）in sera of HEV-infected pregnant and non-pregnant women

2. 3 全血中补体C3aR、CD55 和CD59 的表达水平与未感染HEV 的非孕妇患者相比，感染HEV 的非孕妇患者全血中补体C3aR 表达水平较显著上升（t=11. 32，P < 0. 01），补体 CD55 表达水平显著上升（t =6. 293，P < 0. 05），补体 CD59 表达水平无明显差异（t = 1. 194，P>0. 05）。与未感染HEV 的孕妇相比，感染HEV 的孕妇患者全血中补体C3aR 和CD55 表达水平均极显著上升（t 分别为37.92 和46.32，P均 <0. 001），补体 CD59 表达水平显著上升（t = 9. 624，P < 0. 05）。表明HEV 感染会激活补体调节蛋白的大量表达。与感染HEV 的非孕妇相比，感染HEV 的孕妇补体C3aR、CD55 及CD59 的表达水平更高，见图3。表明HEV 感染会促进患者补体其他成分C3aR、CD55、CD59 表达量增加，且孕妇患者显著高于非孕妇患者。

图3 HEV 感染补体调节蛋白和补体受体的表达的促进作用Fig. 3 HEV infection promotes expression of complement regulatory protein and complement receptor

3 讨 论

作为有机体天然免疫的一部分，补体的激活参与了病原体的识别、清除过程［3］。近期一些研究热衷于宿主先天免疫蛋白，如补体固有蛋白、级联反应相关受体、产物（C3、C3aR、C5aR 和 C5adesArg 等）与炎症反应的关系等［14-16］。正常人血清中的补体含量不随机体的免疫反应增强而升高，基本趋于稳定状态。肝脏是合成补体的主要场所，因此补体含量的变化对监测肝病患者肝脏损伤程度有一定的价值［2］。作为血清中含量最高的补体成分，C3 是各种补体激活途径的汇合点，在补体调节通路中发挥重要作用，因此C3 测定可反映总补体水平，是衡量体液免疫的重要指标［17］。研究同样发现，C4 的缺陷会使细胞发生持续感染，引起自身免疫攻击［18］。CD55 作为一种补体抑制剂，可以抑制C3、C4 裂解避免补体异常激活导致的损伤［19］。有报道称，补体的激活与肝脏炎症的发展及肿瘤的发生有关，如在肾炎患者及肝炎患者体内均发现补体表达量发生变化［4，8，20］。在之前的研究中发现，HIV-1、麻疹病毒和柯萨奇病毒CVB3等均可导致补体在体内的异常表达，促进病毒在体内持续复制［21］。这也预示了补体在病毒入侵机体过程中发挥重要作用，可能通过调控补体组分以治疗相关疾病。

本研究对HEV 感染患者的血清和全血进行检测，探究不同人群HEV 感染患者补体表达水平。结果显示，HEV 感染会激活非孕妇患者及孕妇患者补体C3、C3aR、CD55、CD59 的表达水平，且在孕妇患者中显著增高。补体的激活参与机体抗HEV 的过程，但HEV 感染患者中孕妇由于体内激素的调节及自身抗病毒能力较弱，使得HEV 感染在孕妇中死亡率较高，说明HEV 在孕妇体内补体水平的升高可能是导致孕妇体内病毒复制能力较强的原因之一。因此，研究孕妇体内补体激活与病毒复制的关系显得尤为重要，但有关补体表达参与免疫效应的机理仍需进一步研究。可通过阻断补体的激活来预防HEV在孕妇体内的复制，预防疾病的发生。本研究证明，HEV 感染调控补体系统的表达，HEV 感染孕妇患者体内补体表达大量增加，这为进一步探讨HEV 在孕妇中的致病机制奠定了理论基础。