肾移植供者和受者HLA抗原频率配合度回顾性研究分析

姜梅 魏金凤 托娅

肾移植作为终末期肾病的有效治疗手段，经过多年的发展，在临床上已经得到很大的进步，伴随着肾移植手术方法的不断改进以及新型免疫抑制剂的面世，提高肾移植受者的远期存活率成为临床研究的重点方向。理想的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) 配型有益于移植肾长期存活已经成为临床共识，HLA错配程度是刺激同种免疫应答的基础。受体和供体的HLA不匹配引发的细胞和抗体介导的排斥反应成为影响器官移植生存期的主要免疫障碍[1]。由于HLA系统具有高度多态性，导致移植受者在寻找供肾时难度较大。本研究旨在通过研究肾移植供、受者HLA-A、B、DR、DQ抗原数据，了解HLA抗原的分布频率，为移植受者的HLA配型提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象 入组对象为1 378例肾移植受者和102例供者，于2010年1月至2020年8月在解放军联勤保障部队北戴河康复疗养中心接受肾移植术前HLA-A、B、DR、DQ抗原检测的肾移植受者，年龄18～60岁，男882例，女496例，均为首次移植。1.2 实验仪器与试剂 DNA提取试剂和HLA分型试剂均由美国莱姆德公司生产。重组Taq聚合酶来自美国Immucor公司。运用特异性引物PCR技术(PCR sequence-specific，PCR-ssp) 进行HLA-A、B、DR、DQ抗原分型。

1.3 试验方法 DNA提取：采用全血标本，严格按照试剂操作说明书提取DNA，并测定DNA浓度和 纯 度， 要 求DNA 浓 度 为25 ～200 ng/μL，A260/A280比例在1.65～1.80。

扩 增：①取 一 支D-Mix，加 入Taq 酶7 μL(5 U/μL)、待测标本DNA 111 μL，充分混匀。②将混匀后的样本加入96孔板，每孔加入10 μL。③放入PCR仪进行扩增，扩增条件：96 ℃130 s，63 ℃60 s，1个循环;96 ℃10 s，63℃60 s，9个循环；96 ℃10 s，59 ℃50 s，72 ℃30 s，20个循环，退火至4 ℃结束。

电泳：将扩增产物转移至2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，150 V, 3～4 min。在暗箱式紫外灯下观察结果，采用试剂公司提供的软件分析HLA结果。将所有入组病例结果录入Excel表格行统计分析。

2 结果

2.1 肾移植受者及供者HLA-A抗原分布频率

受者HLA-A抗原共出现19种。其中A2抗原出现频率最高，达27%；其次为A11，A24抗原，分别为20%和17.8%；现频率最低的有A28、A66、A80(均为0.07%)。供者HLA-A共有12种，其中A2出现频率最高，达32.4%，其次为A11、A24，分别为16.7%和18.6% ；A23 和A29 出 现 频 率 最 低( 均 为1.5%)。供受者HLA-A 抗原出现频率，见表1。

表1 供受者HLA-A抗原出现频率[n(%)]

2.2 肾移植受者及供者HLA-B抗原分布频率本组病例中，受者HLA-B抗原共出现42种，分布频率最高的是B13 (13.4%)，分布频率最低的是B17、B24、B76(均为0.07%)。

供者HLA-B抗原共有25种，其中出现频率最高的是B13(12.7%)，最低的是B67和B56、B49(均为0.5%)。供受者HLA-B抗原频率，见表2。

表2 供受者HLA-B抗原频率[n(%)]

续表2 供受者HLA-B抗原频率[n(%)]

2.3 肾移植受者及供者HLA-DR抗原分布频率受者HLA-DR共有16种，DR15抗原分布频率最高(24.0%)；分布频率最低的是DR18(0.6%)。

供 者HLA-DR 共 有14 种，分 别 为DR1、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR10、DR11、DR12、DR13、DR14、DR15、DR16、DR17。DR9抗原分布频率最高(18.6%)；分布频率最低的是DR10(0.5%)。供者中未检出DR6和DR18。供受者HLA-DR抗原分布频率，见表3。

表3 HLA-DR抗原分布频率[n(%)]

2.4 肾移植受者及供者HLA-DQ抗原分布频率受者和供者中HLA-DQ均出现7种，受者出现频率最高的是DQ6 (21.7%)，频率最低的是DQ8(5.2%)；供者出现频率最高的是DQ7(25%)，最低的是DQ8(4.4%)。HLA-DQ抗原频率，见表4。

表4 HLA-DQ抗原分布频率[n(%)]

3 讨论

HLA基因位于第六号染色体的短臂上，是人类主要组织相容性复合物(MHC)的表达产物，在免疫应答和调节异体移植排斥作用中起到重要作用。HLA错配程度是刺激同种免疫应答的基础，研究认为由于HLA错配而产生的新生供者特异性抗体(dnDSA)是目前影响移植器官长期存活的主要因素[2-4]。HLA抗原配型的相合程度对于避免移植后供者特异性抗体的产生、降低排斥反应的发生概率有着积极作用[5]，对肾移植术后远期生存率有着较大影响[6-7]。因此寻找HLA匹配的供肾是临床医生和移植患者的共同愿望。然而由于HLA是具有高度复杂多态性的人类基因系统，寻找HLA高度相合的供肾并不容易，国外大型的肾移植中心能够达到HLA抗原完全无错配也不到8%[8]。因此，了解HLA抗原分布频率，对于肾移植受者寻找理想的供肾有着积极意义。

本组研究中供、受者HLA-A抗原出现频率最高的均为A2 抗原，其次为A11 和A24，提示在HLA-A抗原组中具有A2、A11、A24的受者更容易找到相匹配的供体，这与马锡慧等[9]和Arnaiz-Villena等[10]的研究相同，但Pei Y等[11]的研究结果认为A11的分布频率最高。这应该和研究者所采用样本人群的地域、人种、民族有关。研究表明[12]黄种人未发现A34、A66和A74，而本组数据显示黄种人也存在A34、A66和A74。

HLA-A、B抗原与移植排斥有着密切关系，当慢性移植肾功能减退或慢性移植肾功能丧失时，多数伴随HLA-I类抗体升高[13]。因此寻找HLA-A、B抗原相匹配的供肾对移植受者的长期生存、降低排斥反应的发生概率有着重要意义。本组受者中发现HLA-B抗原有46种，供、受者组HLA-B出现频率最高的均为B13，出现频率最低的并不相同，显示了HLA-B抗原的多态性。供者HLA-B只检出26种，这与供者样本量小有关，也反映出供体的缺乏。由于HLA-B抗原的多态性，以及供者的数量不足使受者更难找到HLA-B抗原匹配的供肾。

早期研究即已表明，HLA-DR抗原与肾移植后早期排斥反应的发生率、以及排斥反应的严重程度有关[13]。受者HLA-DR通过将供者HLA短肽呈递给辅助性T细胞，诱导B细胞分化为浆细胞，进而导致dnDSA的产生，受者体内dnDSA本组病例中受者和供者出现频率最高的均为DR15。受者中出现频率最低的是DR18，供者中未检出DR18，从一定程度上说明DR18在本地区人群中分布频率不高。

随着研究的深入，HLA-DQ在移植免疫中的作用越来越得到重视，王婷等[14]的研究发现，在移植后产生的dnDSA的受者中，73%是抗HLA-DQ的dnDSA，是影响移植肾长期存活的独立危险因素。本组数据中供、受者HLA-DQ出现的种类相同，但出现频率最高的并不相同，表明HLA-DQ的种类虽不多，但由于供体紧缺以及HLA的基因多态性，寻找匹配的供肾仍然存在难度。供、受者HLA基因分布频率的不同是否与肾脏疾病的发生有关还有待进一步研究。

本研究的不足之处在于样本量不够大，尤其是供者数量少，并且患者均来自本省及相邻地区，受到民族和地域的影响，因此在研究结果上存在局限性。我国目前实行公民逝世后自愿捐献器官的政策，虽然已经在社会各界的支持下取得了巨大进步[15]但仍需要进行大力宣传以提高公民对于逝世后器官捐献的认知度，扩大供肾来源，才能使移植受者有更多的机会寻找HLA抗原相容度高的供体。正在发展中的HLA分子配型比目前采用的HLA抗原配型更为精准，它通过分析结构表位、氨基酸和静电等错配特征，有希望为移植等待者找到更匹配的供肾。