增补UV-B辐射对菥蓂生理特性及次生代谢产物的影响

黄志慧 张一宁 李娜娜 郑宝江 张玉红*

（1. 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040；2. 黑龙江省林源活性物质生态利用重点实验室，哈尔滨150040；3. 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

近年来由于人类活动、工业化进程加快和环境污染，导致大气层中的臭氧层逐渐被破坏，致使到达地面环境中UV-B 紫外线（280～315 nm）辐射不断增加［1］。已有的研究表明［2］，过量的UV-B 辐射影响植物的光合生长和生理代谢作用，对植物造成不同程度的伤害，甚至会导致植物的死亡。烤烟（Nicotiana tabacum）在增补中UV-B 处理后，叶绿素含量下降，而且下降幅度与辐射强度呈正相关［3］；葡萄（Vitis vinifera）在UV-B 辐射增强处理后会导致光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率受到抑制［4］。植物为适应环境，维持正常的生理活动，能够通过多种途径最大限度地调节自身防御系统来抵御不利环境的影响。适宜强度的UV-B辐射可以促进杜仲（Eucommia ulmoides）的叶绿素含量的提高［5］；不同强度UV-B 辐射能够提高香蒲（Typha orientalis）中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶的活性，以及渗透调节物质和次生代谢产物的含量来缓解对不利环境的适应［6］。药用植物作为植物中的特殊部分，UV-B 辐射会通过影响植物的生理代谢，进而对药用植物中次生代谢产物的合成效率、含量和产量发挥作用［7］。刘英等［5］研究表明，不同UV-B 辐射强度能促使1 年和3 年生的杜仲中黄酮、总酚、单宁等次生代谢产物的质量分数均显著提高，而中、高强度UV-B 辐射能够导致颠茄（Atropa belladon⁃na）叶片与茎中次生代谢产物——莨菪碱和东莨菪碱含量的显著降低［8］。因此，研究药用植物在UV-B 辐射下的对植物生理特性及次生代谢产物的响应，对药用植物的资源培育、生长发育和开发利用有着重要的实践意义。

菥蓂（Thlaspi arvense）是十字花科（Cruciferae）菥蓂属（Thlaspi）一年生草本植物，在我国广泛分布，常生长在山坡、草地和路旁［9］。菥蓂是我国传统的药用植物，含有黑芥子苷、芥子酶等次生代谢产物，被历版中华人民共和国药典所收录，全草可入药，有清肝明目、清热利尿、解毒和祛风湿等功效［10］。目前对菥蓂的研究主要集中在其有效成分的提取、分离以及化学成分的鉴定等方面［11］，而对菥蓂的逆境生理少有研究。本文通过增补UV-B辐射对菥蓂的光合指标、渗透调节产物、抗氧化酶系统和次生代谢产物含量的研究，可为菥蓂的抗逆性培育和进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

于2020 年4 月初，在东北林业大学森林植物生态学教育部重点试验室的温室内进行菥蓂的培育。菥蓂种子采自黑龙江省北安市。种子播种在土壤配比为V（腐殖质土）∶V（蛭石）=3∶1 的长方形塑料盆里，待菥蓂生长到4～6 片叶时移植到花盆中，每盆移栽3 株，进行日常管理，确保水分、养分供应。当菥蓂2个月龄时，选取生长状况相对一致的菥蓂幼苗，分成3组，每组40盆，放置在2 m×1 m的矩形架内，四周均用黑布遮挡，每组之间用黑布隔开，以防止干扰。在自然光照基础上，于植株上方悬挂40 W紫外灯管（北京光电研究所）作为增补UV-B 的光源（280～310 nm），每天照射12 h（06：00—18：00），阴雨天除外。2 种处理的UV-B 辐射强度分别为3.26 μW·cm-2（T1）、9.78 μW·cm-2（T2）。以正常光照生长的菥蓂幼苗为对照（CK），为保证植物所受光照一致，在对照组上方设置与试验组相同高度的空灯架。UV-B 辐射强度通过紫外辐照计（UV340B，西安欣宝科仪有限公司）进行测定。分别进行UV-B 照射处理（0、6、12、24、36、48、60 h），每个时间段处理结束后的第2 天同一时间取样，样品经液氮冷冻后转移至冰箱中-80 ℃保存，用于各项指标的测定。依据预试验结果确定进行UV-B照射处理48 h后的第2天上午分别进行光合指标的测定。试验期间统一管理，定期浇水，减少其他干扰。每个处理设置3次重复。

1.2 光合指标的测定

选择晴天的08：00—11：00，利用便携式光合仪（Li-6400，美国LI-COR 公司）测定净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2摩尔分数（Ci）、蒸腾速率（Tr）。测定时CO2摩尔分数设定为450 μmol·mol-1、光合有效辐射强度为800 μmol/（m2·s），温度为25 ℃。气孔限制值（Ls）利用如下公式计算：

式中：Co表示测定时环境的CO2摩尔分数，为450 μmol·mol-1。

1.3 叶绿素荧光参数的测定

在菥蓂叶片暗适应20 min 后，利用便携式叶绿素荧光仪（PAM-2500，德国WALZ 公司）进行叶绿素荧光参数的测定。分别测量各处理下叶片的初始荧光强度（Fo）、最大荧光强度（Fm）、PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、PSⅡ潜在光化学效率（Fv/Fo）、非光化学淬灭系数（QNP）、光化学淬灭系数（Qp）和电子传递速率（RET）。

1.4 光合色素含量的测定

叶绿素a、叶绿素b 含量的测定参照JIANG等［12］的方法，取菥蓂叶片0.05 g，放入离心管中，加入5 mL 二甲基亚砜，60 ℃避光超声提取至叶片组织变白，采用紫外分光光度计（UV-2250，日本岛津公司）测定649、665 nm 波长下的吸光值。利用下面公式计算叶绿素a（CChla）、叶绿素b 质量分数（CChlb）：

1.5 生理指标测定

采用高俊凤［13］的方法测定以下生理指标：丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法，脯氨酸含量的测定采用酸性茚三酮染色法，过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定采用Zhnag等［14］的方法进行测定。

1.6 次生代谢产物测定方法

总酚、总黄酮含量测定：称取菥蓂烘干后的叶片0.5 g，研磨成粉状倒入50 mL 具塞离心管中，每组3 次重复，向离心管中加入甲醇25 mL，称其重量并计数，然后进行超声处理（250 W，40 kHz）30 min，静置室温，再次称重并用甲醇补足损失的重量，摇匀离心（10 000 r∙min-1，20 min），后吸取上清液，用于测定总酚、总黄酮含量。采用福林酚法［15］测定总酚含量，氯化铝比色法［15］测定总黄酮含量。

黑芥子苷含量测定［16］：选取新鲜菥蓂叶片2 g置于预冷的研钵中，加入40%乙醇5 mL 在冰上研磨形成匀浆，每组3 次重复，将匀浆转移到50 mL离心管中，再用40%乙醇10 mL 冲洗2～3 次研钵，摇匀后放入冰箱4 ℃静置30 min，将其超声处理（250 W，40 kHz）1.5 h 后过滤，滤液用于黑芥子苷含量的测定。采用HPLC 法测定菥蓂中黑芥子苷的含量。

1.7 数据分析

利用SPSS 17.0 软件分析试验数据，采用单因素方差分析方法比较各处理间的差异。采用Dun⁃can法，对试验数据进行多重比较（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 增补UV-B辐射强度对菥蓂叶片光合特征的影响

2.1.1 对菥蓂叶片气体交换参数的影响

由表1可知，UV-B辐射T1和T2处理下菥蓂叶片的净光合速率显著低于CK，而气孔限制值则与之相反，T1和T2处理组显著高于CK（P＜0.05），但两参数在T1 和T2 处理组之间无显著差异。菥蓂叶片的气孔导度、胞间CO2摩尔分数与蒸腾速率随UV-B 辐射强度的增加而下降，T1 和T2 处理组均显著低于对照组CK（P＜0.05），并且T2 处理组均大于T1处理组。

表1 不同强度UV-B辐射对菥蓂叶片气体交换参数的影响Table 1 Effects of different intensities of UV-B radiation on gas exchange parameters of T.arvense leaves

2.1.2 对菥蓂叶绿素荧光特性的影响

由表2 可知，在T1 和T2 处理下的Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、Qp和RET均显著低于对照组（P<0.05），并且2个处理组间差异显著（P<0.05），T2 低于T1。Fo在CK、T1 和T2 处理组间差异均不显著。T1 和T2 处理组的QNP均显著高于CK（P<0.05），但2 个处理组间无显著差异，紫外胁迫提高了菥蓂叶片的QNP。

表2 不同强度UV-B辐射对菥蓂叶绿素荧光参数的影响Table 2 Effects of Different Intensities of UV-B radia‐tion on chlorophyll fluorescence parameters of T.arvense

2.1.3 对光合色素含量的影响

T1 和T2 处理组随辐射时间的延长，叶绿素a含量呈现先升高后降低，再升高再下降的双峰曲线，辐射强度越大，峰值到达的时间越早。叶绿素b 含量与叶绿素a 含量的变化趋势相似，但在24 h之前，各处理组间没有显著差异（P＞0.05）（见图1）。叶绿素a 含量在处理36 h 之前T2 组高于T1组，随后则T2显著低于T1组（P<0.05），而叶绿素b在24h 和36h 时T2 显著高于T1，随后则T1 高于T2，且随着处理时间延长呈下降趋势，但无论是叶绿素a 还是叶绿素b 在24h 之后T1 和T2 组均显著高于CK（P<0.05）。

图1 不同强度UV-B辐射处理对菥蓂叶绿素含量影响不同小写字母代表同一辐射时间内，各处理组之间差异显著（P＜0.05），下同Fig.1 Effects of UV-B radiation treatments at different intensities on Chlorophyll content of T.arvense Different lowercase letters represent the same radiation time，and there were significant differences among the treatment groups（P<0.05），the same as below

2.2 增补UV-B 辐射增强对菥蓂渗透调节物质含量的影响

如图2 所示，同一辐射强度下，4 种物质的含量均随辐射时间的延长呈先升高后降低趋势，丙二醛和可溶性糖含量均在处理12 h 时出现峰值，并且丙二醛峰值T2＞T1＞CK 组，而可溶性糖在48 h之前2个处理组均显著高于CK，但T1和T2组之间却无显著差异（P＞0.05）；游离脯氨酸中T2 组和T1组分别在12和24 h出现峰值，而可溶性蛋白含量比游离脯氨酸的出峰时间晚了12 h，分别在24和36 h达到峰值，并在48 h之内T1和T2组均显著高于CK，除24 h外，T1均显著高于T2（P<0.05）。

图2 不同强度UV-B辐射对菥蓂叶片渗透调节物质的影响Fig.2 Effects of different intensities of UV-B radiation on osmotic regulators in leaves of T.arvense

2.3 增补UV-B辐射增强对菥蓂抗氧化酶活性的影响

在增补2 种UV-B 辐射强度处理下，菥蓂中过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物岐化酶和抗坏血酸过氧化物酶4种抗氧化酶活性，均随辐射时间的延长呈先升高后下降的趋势；POD 活性在36 h 时达到峰值，并且T2处理组显著高于T1处理组（P＜0.05），随后则T2 处理组显著低于T1 处理组，且随着时间延长呈下降趋势；对于CAT和SOD，T1组和T2 组分别在12 h 和6 h 达到峰值，CAT 活性在12 h之后均表现为T1 显著高于T2，并在36 h 之前2 个处理组显著高于CK，之后低于CK，而SOD 活性在24 h 之前2 个处理组显著高于CK，之后（除48 h）T2 显著高于T1 和CK，而T1 和CK 之间无显著差异；APX 活性中T1 组和T2 组分别在处理后的12 h和24 h 出现峰值，并且在24 h 之前T1 显著高于T2，随后则（除48 h外）2个处理间无显著差异（P＞0.05）在整个辐射过程中2 个处理组的活性均显著高于对照组（见图3）。

图3 不同强度UV-B辐射对菥蓂叶片抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of different intensities of UV-B radiation on the activities of antioxidant enzymes in the leaves of T.arvense

2.4 增补UV-B辐射对菥蓂次生代谢产物的影响

由图4 可知，在增补UV-B 辐射下随辐射时间的延长，2个处理组中菥蓂叶片的总黄酮含量有上升趋势，T1、T2处理分别从24 h和12 h后均显著高于CK（P＜0.05）并且2 个处理组间从24 h 开始无显著差异（P＜0.05）；菥蓂中的总酚，随辐射时间的延长呈先升高后降低趋势，不同辐射强度下的总酚含量达到峰值的时间不同，T2 组（36 h）早于T1 组（48 h），总酚峰值也是T2 处理组（8.701 mg·g-1）大于T1 处理组（8.446 mg·g-1），但差异不显著（P＞0.05），在整个处理过程中T1 和T2 处理组均显著高于CK，并且除12 h 处理外，2 个处理组间无显著差异（P＜0.05）；在增补UV-B 辐射下随辐射时间的延长，菥蓂叶片中黑芥子苷的含量呈先上升后下降趋势，T1 和T2 处理在6 h 时达到峰值，并且2个处理组的峰值均显著高于CK，且T2＞T1（P＜0.05），T1（2.868 mg·g-1）和T2（3.292 mg·g-1）处理组的黑芥子苷的含量分别是对照（1.725 mg·g-1）的1.66 和1.91 倍，随辐射时间的延长，T1 和T2 处理组中黑芥子苷的含量分别在24 h 和60 h 均显著低于CK组（P＜0.05），并且T1组呈逐渐下降趋势。

图4 不同强度UV-B 辐射处理对菥蓂叶片次生代谢物质的影响Fig.4 Effects of UV-B Radiation Treatments at different intensities on secondary metabolites in the leaves of T.arvense

3 讨论

光，包括UV-B（280～320 nm），是控制植物生长发育的最重要的环境因素之一。光提供能量来支持植物光合作用和生长发育及生理代谢。不同波长的光提供不同的环境信号来改变植物的发育过程。UV-B 辐射光与其他波长的光不同，是由于UV-B 的高能量和吸收它的分子范围有限，过量会导致植物细胞受损。因此，植物为保护自己免受UV-B 的伤害，植物会根据受伤害程度启动体内广泛的防御系统，来抵御和修复自己所遭受的UV-B伤害，最大程度上维持正常的生命活动［17］。

光合作用在植物生长发育过程中起着重要作用，增补UV-B 辐射下植物的光合作用受到一定程度影响［4］。本研究中随紫外辐射增强，菥蓂中净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间CO2质量浓度不断降低，而气孔限制值却增加，这可能是植物在UV-B辐射下由于受气孔因素所造成部分气体交换参数的下降［18］。增补紫外辐射使菥蓂叶片的Fv/Fm、Fv/Fo、Fm、Qp、QNP、RET等叶绿素荧光参数值下降，可能是植物叶片受到了光抑制，使PSⅡ反应中心活性受到影响，并且电子传递受阻以及光能合成化学能效率降低［19］，对黄檗（Phellodendron amu⁃rense）叶片在增补UV-B 辐射下也得到相同的结果［20］，有研究表明，叶绿素作为植物进行光合作用的重要色素之一，可以通过含量的高低直接或间接影响植物的生长发育进程［21］，本试验中随着辐射时间的延长，叶绿素含量呈先小幅度上升后下降趋势，虽然在辐射后期2个处理组中叶绿素含量呈下降趋势但仍高于对照，因此紫外辐射促进了菥蓂叶绿素含量的合成，可能与植物抗紫外胁迫能力的强弱有关［5］。

植物在UV-B 辐射下，会加快膜质过氧化的速度，丙二醛含量可以间接体现出植物膜系统结构的受损程度［22］，在本研究中随辐射时间的延长，菥蓂中丙二醛含量呈先上升后下降趋势，可能是随着UV-B 辐射时间的延长，菥蓂叶片中部分抗氧化酶活性不断升高，活性氧自由基被直接或间接地清除，减轻了膜系统的受损程度，致使丙二醛的含量逐渐减少［6］。多数植物在胁迫环境下都可通过自身的渗透调节系统来缓解胁迫带来的压力进而维持正常的生理活动［23］，本研究中游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白均随辐射时间的延长呈先升高后降低趋势，这与孟凡来等［24］对甘薯（Dioscorea esculenta）的研究结果相似，除游离脯氨酸其他渗透调节物质的2个处理组均大于或等于对照组，而游离脯氨酸在辐射末期处理组低于对照，可能是随着辐射剂量的积累，游离脯氨酸的积累受到抑制［25］。

逆境下植物体内会产生大量的活性氧自由基，将导致植物进行光合作用时受到损害，而植物清除活性氧自由基可以通过体内的抗氧化酶系统来进行［22］，本研究表明，4 种抗氧化酶都表现出先升高后降低的趋势，而SOD、CAT 活性先于其他2种抗氧化酶达到峰值，并且辐射强度越大，出现的峰值越早，可能是随着UV-B 辐射逐渐增加，植物体内活性氧自由基大量累积，最先接受到清除信号的是SOD［26］，而SOD 在植物细胞内主要是将O2-歧化为 -·O2和H2O2，然后通过CAT、POD 和APX 直接或间接的清除H2O2，它们之间相互协作使植物保持正常的生理活动［27］，但CAT 在处理末期T1 和T2 均低于对照，可能在长时间辐射剂量累积下超出了菥蓂自我调节的阈值导致CAT 活性下降，而其他3 种抗氧化酶均高于对照或与对照无显著变化，可能是因为菥蓂适应能力增强所导致。

植物在逆境下以细胞分化为主细胞生长为辅，而次生代谢产物是植物细胞分化产生的一种特定物质［28］。孟祥才等［29］活性氧假说中认为植物在逆境下产生的活性氧会影响抗氧化酶活性的变化，而次生代谢产物含量会增加。本研究中，在增补UV-B 辐射下，菥蓂中的总黄酮含量持续增高，并且总黄酮和总酚含量分别在辐射处理24 h 和12 h 之后均显著（P＜0.05）高于对照，作为能够吸收有害辐射物质的黄酮和酚类物质多存在于表皮细胞的液泡里，随着紫外辐射剂量的增加和时间的延长，植物启动应激防御系统，会促使植物本身快速合成黄酮和酚类物质，进而促进植物对胁迫环境下的抵御能力，缓减紫外辐射对自身的伤害［30］。黑芥子苷是一种含氮、含硫的次生代谢产物，是菥蓂中重要的芥子油苷类物质，本研究中菥蓂在增补UV-B 辐射下，黑芥子苷的含量在短时间内呈先上升后下降趋势，而在辐射未期黑芥子苷的含量低于对照，可能是由于菥蓂在受到UV-B 辐射后，引起体内碳/氮分配发生了变化，使碳从植物生长为主转移到了产生具有保护、防御功能的、以碳为基础的初生代谢和次生代谢产物中，从而不利于以氮为基础的含氮次生代谢产物的合成［8］。

4 结论

两种辐射强度下菥蓂的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间CO2质量浓度等光合指标、叶绿素最大荧光参数（Fm）、PSⅡ原初光能转换效率（Fv/Fm）和PSⅡ潜在光化学活性（Fv/F0）等叶绿素荧光参数均随辐射强度增大而降低；叶绿素a和叶绿素b、丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化氢酶活性、总酚和黑芥子苷等次生代谢产物含量均随辐射时间增加呈现先上升后下降趋势，而总黄酮含量呈逐渐上升趋势，在辐射未期与对照差异显著（P＜0.05）。总体而言，在不同辐射强度下，菥蓂通过提高总黄酮和总酚含量的合成、可溶性蛋白和可溶性糖的积累、以及叶绿素含量、超氧化物岐化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化氢酶活性的增加，抵抗紫外胁迫对其造成的影响，进而得出菥蓂具有较强的抗紫外胁迫能力，这为菥蓂抗逆性培育和进一步利用提供理论基础。