响应面法优化腐乳后酵工艺抑制白点的产生

胡雪芬，张锦航，李二虎

(华中农业大学 食品科技学院，武汉 430072)

腐乳是中国传统发酵豆制品之一，因具有奶酪般的丝滑口感而被称为“东方奶酪”[1]。腐乳在发酵过程中，微生物产生的蛋白酶系将大豆蛋白水解为小分子可溶性短肽和游离氨基酸[2-4]，不仅有利于人体对豆制品的消化吸收，而且促进了腐乳风味的形成，带来丰富的味觉层次。当腐乳中酪氨酸的含量达到过饱和时，腐乳表面会出现白色结晶，即俗称的“白点”[5]。

白点的主要成分为酪氨酸和苯丙氨酸[6-7]，广泛存在于一些盐腌的高蛋白食品中，如盐腌贝类、牡蛎、鳍鱼、猪肉、奶酪和东方特色的大豆发酵制品(酱油、豆瓣酱、腐乳以及豆豉等)，白点带来的颗粒感和苦涩感会显著降低腐乳的品质[8-12]。

酪氨酸的溶解度低，极易形成结晶，相关研究表明，酪氨酸的形成与酪氨酸羧肽酶的活性密切相关。目前抑制腐乳中白点产生的主要途径是增加酪氨酸的溶解度或减少酪氨酸的产生[13-14]。研究表明，酒精度[15]、温度[16]和盐含量对蛋白酶活性均有显著的抑制作用，影响腐乳发酵过程中大分子物质的水解。Qiu等[17]研究发现，在腐乳发酵过程中，乙醇的添加会降低腐乳中脱羧酶的活性，从而抑制酪氨酸的生成。乙醇在腐乳前发酵阶段也会对乙酰胆碱酯酶的活性产生一定抑制作用[18]。盐含量的高低会影响腐乳中酶的活性，从而影响腐乳的成熟时间。因此，可以通过优化这些因素来抑制酪氨酸羧肽酶的活性，从而减少酪氨酸的生成。本文通过单因素试验结合响应面试验的方法探究温度、盐浓度、酒精含量3个因素对酪氨酸含量的影响，并结合感官评价来综合评估出最佳后酵条件，为腐乳中白点的抑制及腐乳品质的提高提供了参考。

1 材料和方法

1.1 材料

老豆腐：购于武汉明利和丰股份有限公司；毛霉菌粉：购于成都曲赋生物科技有限公司。

1.2 试剂

L-酪氨酸、4-氨基安替比林、氯化铵、盐酸、高碘酸钠(纯度99.5%)：国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

SPX-250B生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；UV-1700紫外可见分光光度计 日本岛津公司；DTT-A1000 电子天平 美国康州HZ电子有限公司。

1.4 方法

1.4.1 腐乳的制备

将购置的老豆腐切成2 cm×2 cm×1 cm规格大小的白坯，摆盘。将1.6 g的毛霉菌用1 L 25 ℃的温水浸泡20 min，用4层纱布过滤，取过滤后的菌液喷洒豆腐表面，每5 kg白坯接种的毛霉菌量不少于8 g。将接菌后的白坯用布密封，置于20 ℃、87%湿度的环境下发酵2 d。取布后晾凉，搓毛，使腐乳毛坯表面形成致密皮膜，保护腐乳的完整性。搓毛完成后得到腐乳毛坯，装盘腌制。腌制方法：首先称取固量的盐，先在盘底撒上一层盐，接着将毛坯均匀放在盘中，再在毛坯表面均匀撒盐并置于室温下干腌2 d；干腌结束后，在盘中加入不同浓度的盐水湿腌2 d，并在毛坯上盖压一定重量的板子，目的是将毛坯中的水分腌出；湿腌结束后，滤去盆中多余水分，即得盐坯。腌制完成后将盐坯装罐，罐容积固定为225 mL，每罐装入12块盐坯并加入一定体积的汤料，加盖后进行后期发酵。

1.4.2 酪氨酸溶解度的测定

采用酪氨酸与4-氨基安替比林的显色反应测定食品中酪氨酸的含量[19]。

腐乳中酪氨酸含量的测定：取待测腐乳成品，用滤纸吸干表面水分，均匀研磨成糊状，准确称取5 g，加入6 mL 1 mol/L盐酸于20 mL刻度试管中，静置反应1 h，微波加热30 s，过滤，蒸馏水定容于50 mL容量瓶中。取5 mL待测液于50 mL容量瓶中，依次加入5 mL 5.0×10-2mol/L 4-氨基安替比林，2.5 mL NH4OH-NH4Cl缓冲溶液(pH 9.40)，2.5 mL 0.1 mol/L高碘酸钠溶液，二次水定容至50 mL。显色25 min后，于25 ℃在480 nm波长下测定腐乳样品的吸光度值,重复3次。

标准曲线的绘制：准确称取0.1000 g酪氨酸，用1 mol/L HCl溶液稀释后定容至100 mL，再吸取10 mL稀释液，用0.1 mol/L HCl溶液定容至100 mL，使其终浓度为100 g/mL。分别吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL酪氨酸溶液，每管依次加入5 mL 5.0×10-2mol/L4-氨基安替比林，2.5 mL NH4OH-NH4Cl缓冲溶液(pH 9.40)，2.5 mL 0.1 mol/L高碘酸钠溶液，用蒸馏水定容至50 mL，反应25 min后，于25 ℃在480 nm处测定吸光度值，并绘制酪氨酸标准曲线。

1.4.3 感官评定

感官评价表及评价方法参考沈子林等[20]对腐乳感官评价的方法，并稍作修改，对腐乳的规格、色泽、香气、滋味、质地进行综合评定，其中满分为最佳，0分为最不理想。腐乳的感官评价表见表1。

表1 腐乳感官评价表Table 1 The sensory evaluation table of sufu

评价人员：由有相关食品评价经验的实验室工作人员组成，共8名，年龄分布在20～30岁之间，男女比例1∶1。评价人员必须身体健康，有正常灵敏的视觉、嗅觉、味觉；评价人员必须具有一定的品评技能，经过集中训练后取得品评资格。

品评室：感官评价室应该陈设简单，光线充足，不存放其他气味的物品，以免干扰腐乳味觉评价。

具体评定步骤：从瓶中取腐乳样品放置于白色小碟上，闻香气；用小刀轻刮腐乳表面，观察有无白点；将腐乳切开，观察腐乳内外部的颜色和切面光泽程度；用筷子前端轻刮腐乳，观察其软硬程度和黏附性；夹取少量腐乳入口，品尝其味道和质地细腻程度。品后漱口，评价人员对同一样品重复评价3次后取平均值。

1.4.4 后酵条件优化单因素试验

1.4.4.1 盐浓度

取腐乳毛坯，腌制盐浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%，置于5个玻璃罐中，然后加入13%酒精含量的汤料，装罐后在25 ℃下后发酵30 d，测定第30天腐乳的酪氨酸含量及感官评分，每个盐浓度分别做3个平行。

1.4.4.2 酒精含量

取腐乳毛坯，腌制盐浓度为8%，放置于5个玻璃罐中，分别加入含量为5%、9%、13%、17%、21%食用酒精的汤料，装罐后在25 ℃下后发酵30 d，测定第30天腐乳的酪氨酸含量及感官评分，每个酒精含量分别做3个平行。

1.4.4.3 后酵温度

取腐乳毛坯，腌制盐浓度为8%，加入13%食用酒精含量的汤料进行装罐，然后分别于15，20，25，30，35 ℃下后发酵30 d，测定发酵完成的腐乳的酪氨酸含量及感官评分，每个后酵温度分别做3个平行。

表2 腐乳后酵的单因素试验Table 2 Single factor experiment of post fermentation of sufu

1.4.5 响应面试验

根据1.4.4单因素试验的结果，选取盐浓度(%)、酒精含量(%)、后酵温度(℃)为试验因素，由于后酵60 d的试验结果更显著，因此以第60天的酪氨酸含量(mg/100 g)为响应值设计试验，试验因素及水平见表3。

表3 响应面设计因素水平及编码Table 3 Factors, levels and codes of response surface design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 盐浓度对酪氨酸含量及感官评分的影响

腐乳盐浓度为腌制时的用盐量与毛坯重量的比值，控制腐乳汤汁中酒精含量为13%及腐乳后酵温度为25 ℃，测得不同盐浓度腐乳中酪氨酸含量及感官评分，结果见图1。

图1 不同盐浓度腐乳后酵过程中酪氨酸含量和感官评分Fig.1 Tyrosine content and sensory scores of sufu with different salt concentrations during post fermentation

由图1可知，在4%～8%盐浓度范围内酪氨酸含量最低，感官评分最高。当盐浓度大于8%时，酪氨酸含量和感官评分都显著降低。因此，选择盐浓度在4%～8%的腐乳进行下一步试验。

2.1.2 酒精含量对腐乳酪氨酸含量及感官评分的影响

在盐浓度为8%及后酵温度为25 ℃的条件下，汤汁酒精含量对腐乳酪氨酸含量及感官评分的影响见图2。

图2 不同酒精含量腐乳后酵过程中酪氨酸含量和感官评分Fig.2 Tyrosine content and sensory scores of sufu with different alcohol content during post fermentation

由图2可知，随着腐乳汤汁中酒精含量的升高，酪氨酸的含量逐渐降低，说明酒精能够抑制腐乳后酵过程中酪氨酸的生成。这主要是由于酒精能抑制微生物的酶系作用，可以抑制羧肽酶活性，减少酪蛋白的过度酶解。同时，酒精可以结合腐乳发酵过程中产生的有机酸等物质，生成酯类等芳香物质，形成腐乳独特的风味[21]。但酒精含量过高会产生明显的酒味，影响腐乳的感官品质，消费者接受度低。当酒精含量大于13%之后，腐乳的感官评分逐渐降低，因此，选择酒精含量在9%～13%左右的腐乳汤汁进行下一步试验。

2.1.3 后酵温度对酪氨酸含量及感官评分的影响

在腐乳盐浓度8%及汤汁中酒精含量13%的条件下，测得不同温度下后酵腐乳中酪氨酸含量及感官评分，结果见图3。

图3 不同后酵温度下腐乳的酪氨酸含量和感官评分Fig.3 Tyrosine content and sensory scores of sufu under different post-fermentation temperatures

由图3可知，随着腐乳后酵温度的升高，腐乳中酪氨酸的含量及感官评分均呈先增加后减少的趋势。后酵温度在20～30 ℃之间，酪氨酸的含量较高。这是因为毛霉菌丝最适的产酶温度为26～28 ℃，在此阶段会生成大量的蛋白酶分解蛋白质，从而使酪氨酸的含量增加[22]。后酵温度过低，腐乳块的口感相对较硬，不利于腐乳达到成熟条件；后酵温度过高，腐乳块较软，易破碎，影响口感。所以，选择15～25 ℃的后酵温度进行试验。

2.2 响应面法优化试验设计及结果分析

在单因素试验的基础上，以盐浓度(A)、酒精含量(B)、后酵温度(C)为自变量，以腐乳中的酪氨酸含量(Y)为因变量设计三因素三水平共17组试验，其中有12个析因点和5个中心点。响应面设计及数据见表4。

表4 腐乳后酵条件的响应面试验设计及数据结果Table 4 Response surface experiment design and data results of post-fermentation conditions of sufu

以盐浓度(A)、酒精含量(B)、后酵温度(C)为自变量，以腐乳中的酪氨酸含量(Y)为因变量，建立回归模型。回归方程：Y=69.63-5.47A-4.99B+3.44C+3.46AB-1.71AC-2.72BC+4.64A2+2.86B2+5.38C2。

为了检验方程的有效性，对结果进行方差分析，见表5。

表5 酪氨酸含量回归模型方差分析结果Table 5 Analysis results of variance of tyrosine content regression model

由表5可知，本试验建立的模型极显著(P<0.01)，因变量与自变量之间的线性关系也极显著(R2=0.9678)。该模型调整复相关系数RAdj2=0.9264，说明该模型能够解释92.64%的响应值的变化，拟合程度很好。模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，模型失拟项的P值为0.6805>0.05，不显著，说明该模型的选择和建立是合理的。

由回归方程系数显著性检验可知，该模型的一次项A、B、C对酪氨酸含量(Y)的影响极显著(P<0.01)；二次项A2、C2对酪氨酸含量的影响极显著(P<0.01)，B2对酪氨酸含量的影响显著(P<0.05)；交互项AB、BC的影响显著(P<0.05)，AC的影响不显著(P>0.05)。由此可知，除AC项外，各因素对腐乳后酵60 d中酪氨酸含量(Y)的影响都十分显著。

根据响应面试验得到响应曲面，特定的响应面(Y酪氨酸含量)与对应的因变量A(盐浓度)、B(酒精含量)、C(后酵温度)共同建立出一个三维空间在二维平面上的等高线图，根据回归方程绘制响应面直观图。曲面越陡峭、倾斜度越高说明各因素之间的交互作用对响应值的影响越大；同一等高线上的每个点表示的数值相同，而等高线的疏密程度及呈现的形状可以反映各因素之间交互作用的显著性。各因素之间的相互作用以及各因素对响应值酪氨酸含量的影响见图4～图6。

图4 盐浓度与酒精含量对酪氨酸含量的影响Fig.4 Effect of salt concentration and alcohol content on tyrosine content

由图4可知，当后酵温度不变时，随着盐浓度和汤汁中酒精含量的升高，酪氨酸的含量均呈现逐渐降低的趋势。由此说明，适当提高盐浓度及酒精含量均能显著抑制后酵过程中酪氨酸的生成，但同时也应考虑到盐浓度和汤汁中酒精含量对感官评分的影响。

图5 盐浓度与后酵温度对酪氨酸含量的影响Fig.5 Effect of salt concentration and post-fermentation temperature on tyrosine content

由图5可知，当盐浓度保持不变时，随着后酵温度的升高，酪氨酸含量呈先降低后升高的趋势；当后酵温度不变时，随着盐浓度的升高，酪氨酸含量呈降低趋势。

图6 酒精含量与后酵温度对酪氨酸含量的影响Fig.6 Effect of alcohol content and post-fermentation temperature on tyrosine content

由图6可知，当后酵温度不变时，酪氨酸含量随着腐乳汤汁中酒精含量的升高而逐渐降低；当腐乳汤汁中酒精含量不变时，酪氨酸含量随着后酵温度的升高呈现先降低后升高的趋势。

盐浓度、汤汁中酒精含量以及后酵温度对腐乳中酪氨酸含量均有显著影响，但相比于盐浓度和酒精含量的变化，后酵温度的变化对酪氨酸含量的影响相对较小。根据模型分析得出优化腐乳后酵条件的最佳工艺参数为盐浓度6.64%、酒精含量11.36%、后酵温度19.45 ℃，在此条件下后酵60 d的腐乳中酪氨酸含量为67.0 mg/100 g。

2.3 最佳工艺条件试验验证

为了检验试验结果与真实情况是否一致，对上述响应面优化腐乳后酵条件进行试验验证。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为腐乳盐浓度6.5%、腐乳汤汁中酒精含量11%、后酵温度20 ℃。使用试验得出的最佳工艺参数进行3次平行试验，求其平均值，得到实际的酪氨酸含量为66.7 mg/100 g。

3 结论

本研究通过单因素试验结合响应面优化试验结果分析得出，盐浓度、酒精含量及后酵温度对酪氨酸含量和感官评分的影响极显著(P<0.01)，盐浓度与酒精含量以及后酵温度与酒精含量的交互作用影响显著(P<0.05)，而盐浓度和后酵温度的交互作用不显著(P>0.05)。腐乳后酵条件最佳工艺参数为盐浓度6.64%、酒精含量11.36%、后酵温度19.45 ℃，在此条件下腐乳后酵60 d时的酪氨酸含量为67.0 mg/100 g。基于此工艺条件，后酵60 d的腐乳中酪氨酸含量最低。

腐乳中白点问题存在已久，长期以来未得到解决，以往的研究多专注于腐乳的前酵过程，通过添加酸、驯化菌种等方式减少腐乳中白点的产生，这些方式往往会给腐乳风味带来不利的影响。本试验专注于优化腐乳的后酵条件，有效地降低了腐乳中的酪氨酸含量，抑制了白点的产生，提升了腐乳的感官品质。