超临界萃取黑姜姜辣素GC-MS分析及降血糖活性研究

王丽媛，周宁，宁月宝*

(1.内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010；2.包头市肿瘤医院检验科，内蒙古 包头 014030)

姜在我国历史悠久，种植面积广泛，是食品的主要调味料之一[1]。姜在日常食品和药物方面都有广泛的应用，是一种非常具有研究价值的植物[2]。生姜中的主要活性成分是姜辣素[3]。姜辣素是姜中所有辣味成分的总称，姜辣素中的主要活性成分有很多，含量最高的是姜酚[4]。姜酚有极高的药用价值，在降血脂、抗氧化、抗肿瘤和抗炎等方面都具有非常显著的效果[5-11]。超临界CO2萃取法可以在接近室温下进行萃取，这样可以有效防止热敏性物质的氧化和逸散。因此，这种方法可以将高沸点、低挥发性、易热解的物质在远低于其沸点的温度下萃取出来，既可获得挥发性成分，又可获得非挥发性成分[12-14]。

姜辣素在食品、药品、保健品等方面具有很大的应用前景，但目前对于姜辣素功能发挥机制的研究还停留在初级阶段，还需进一步探究姜辣素的作用机制。本实验通过对糖尿病大鼠灌胃从黑姜中提取出的姜辣素，观察大鼠血糖值变化，并对从中提取出的姜辣素进行成分分析，以此为理论依据对降血糖药物的研发具有很大的意义，为姜辣素将来在人类疾病治疗领域的应用提供了理论基础。

1 材料

1.1 实验动物及材料

SD大鼠(40只，体重180～220 g，雄性)：购自内蒙古大学实验动物中心；新鲜生姜：购自包头市昆都仑区友谊菜市场。

1.2 药品及主要试剂

四氧嘧啶：购自Sigma公司；生理盐水：购自吉林省都邦药业股份有限公司；无水乙醇、香草醛、正丁醇：购自天津永大化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器

DPMCLJ10超临界(CO2)流体装置 德帕姆(杭州)泵业科技有限公司；DFT-200 200 g手提式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；SHB循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；JA5003分析天平、FA5003电子天平 上海越平科学仪器有限公司；UV-7504紫外可见分光光度计 郑州南北仪器设备有限公司；RE52CS-2旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；601超级恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；751玻璃比色皿 宜兴市晶科光学仪器有限公司；血糖仪、GA-3血糖试条 三诺生物传感股份有限公司；BPS-100CL恒温恒湿箱 上海一恒科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 黑姜的发酵

将处理好的生姜放入恒温恒湿箱内按照规定的条件温度(68.0±1.0) ℃、湿度(95.0±1.0)%进行自然发酵，在多种菌的作用下，发生美拉德反应，发酵30 d即可得到黑姜发酵品[15-16]。发酵后的黑姜营养成分显著升高，辛辣气味减少，是一种天然健康的保健食品[17]。将发酵好的黑姜放入烘干箱中进行烘干，烘干后粉碎，过60目筛备用。

2.2 黑姜姜辣素的提取

采用超临界CO2萃取的方法提取黑姜姜辣素，萃取条件为温度47 ℃、频率25 Hz、压力30 MPa，萃取2 h。在萃取过程中要时刻注意压力变化，使压力在所要求的压力附近，越接近越好，这样产生的误差越小，也能使提取的姜辣素更能达到实验要求。将提取得到的黑姜姜辣素置于棕色样品瓶中，在4 ℃条件下储存。

2.3 黑姜姜辣素含量的测定

2.3.1 香草醛标准溶液的配制

用天平准确称取0.05 g香草醛，用95%乙醇溶解并定容至100 mL，取4.0 mL稀释好的液体于第2个容量瓶中，再次稀释至100 mL，得到浓度为20 μg/mL的香草醛标准指示剂[18]。

2.3.2 标准曲线的绘制

准确吸取香草醛标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，得到浓度为2，4，6，8，10，12 μg/mL的标准溶液样品，以95%乙醇作空白，在280 nm波长处用1 cm比色皿测定吸光度A。

通过吸光度值绘图计算香草醛回归方程，回归方程中的R2越接近1，回归方程越准确。得到线性方程y=0.0267x+0.1774，R2=0.9993(见图1)。

图1 香草醛标准曲线Fig.1 Vanillin standard curve

2.4 气相色谱-质谱联用仪检测条件

色谱条件：流动相氦气作为载气，色谱柱柱前压60.4 kPa，分流比10∶1，升温程序：色谱柱的初始柱温80 ℃，保持时间3 min，然后以20 ℃/min的升温速率升温至140 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的升温速率升温至230 ℃，保持3 min，最后以15 ℃/min的升温速率升温至260 ℃，保持5 min，汽化室温度250 ℃，接口温度250 ℃，色谱柱为Rtx-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.15 μm)。

质谱条件：电子的电离电源为EI源，电子轰击能量70 eV，电子倍增管电压0.8 kV，质量扫描范围15～400 m/z，时间间隔1 s。

2.5 高血糖大鼠模型的建立

2.5.1 动物模型

将大鼠随机分组，选取对照组10只、模型组10只、实验组20只，对模型组和实验组一次性腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液，建立糖尿病大鼠模型[19]。注射前禁食不禁水12 h后，避光环境下注射200 mg/kg四氧嘧啶，对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水作为空白对照。实验组大鼠根据血糖值的不同分为中高血糖组与高血糖组。对照组、实验组每日灌胃200 mg/kg黑姜姜辣素溶液，持续4周，记录灌胃期间大鼠的血糖浓度变化。

2.5.2 血糖测定

在对实验组、模型组和对照组大鼠注射等量的四氧嘧啶溶液及生理盐水72 h后，将大鼠禁食不禁水12 h，在尾部采血，使用血糖仪测定其血糖浓度，当血糖浓度大于7.0 mmol/L时即为建模成功。

3 实验结果

3.1 黑姜姜辣素含量

用超临界萃取法提取黑姜中姜辣素，萃取得到的姜辣素使用香草醛比色法测定得到浓度。准确吸取样品供试液4.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，即为测定样品。多次测量吸光度，结果见表1。

表1 黑姜姜辣素含量表Table 1 Content of gingerol in black ginger

代入香草醛回归方程求出相应浓度C，按下式计算黑姜姜辣素含量：

式中:2.001为香草醛换算姜辣素的系数；C为测定的 A值在回归方程中求出的香草醛浓度，μg/mL；V1为测定的样品溶液总体积，mL；V0为样品提取液总体积，mL；V2为测定时吸取的样品供试液体积，mL；W为样品重，g；106为将微克数换算成克数。

3.2 高血糖大鼠模型的建立结果

在对大鼠注射四氧嘧啶溶液后，将建模成功的大鼠再次分组，模型组10只、黑姜姜辣素灌胃组20只。其中黑姜姜辣素灌胃组又根据其血糖浓度水平进行分组，将血糖浓度在7～15 mmol/L定为中高血糖组，血糖浓度大于15 mmol/L定为高血糖组。实验组、模型组以及对照组一同作为黑姜姜辣素降血糖作用的研究对象。

3.3 黑姜姜辣素灌胃结果

将建模成功的大鼠进行分组后，对大鼠进行每天1次、连续28 d的灌胃，每隔1周测其血糖值，对比灌胃前血糖值的平均值，得到灌胃前后平均血糖浓度变化，见表2。

表2 大鼠血糖浓度变化Table 2 Changes of blood glucose concentration of rats

对实验组、模型组以及对照组灌胃前后血糖浓度值用SPSS 19.0软件分析后，得出中高血糖组、高血糖组的P<0.01，对照组、模型组的P>0.05，说明黑姜姜辣素可以显著降低实验组大鼠血糖浓度，而对照组大鼠的血糖浓度几乎没有变化，模型组大鼠的血糖浓度不但没有下降反而上升了12.97%。

3.4 黑姜姜辣素检测结果

发酵黑姜姜辣素中化学成分的GC-MS总离子流图见图2。

图2 黑姜姜辣素中化学成分的总离子流图Fig.2 Total ion curent diagram of chemical components in black ginger gingerol

使用专业分析软件(SHIMADZU GCMSsolution Release 2.10)对总离子流进行分析，分析结果得到100多种化合物。化合物各组中的相对峰按照面积归一法计算百分比含量[20]。根据所得到的质谱信息可鉴定成分，使用谱库检索数据实行检索。通过与标准图谱相对比，进行化学结构的确认。表3中列出的各物质峰面积在0.10以上，检测出经发酵后的黑姜中姜辣素的主要成分6-姜酚占总含量的7.21%，姜酮占总含量的4.32%。

为了方便观察，现将提取得到的黑姜姜辣素化学成分中主要的几种物质进行总结，结果见表3。

表3 黑姜姜辣素中部分化学成分鉴定结果Table 3 Identification results of some chemical components in black ginger gingerol

4 讨论与结论

本实验采用超临界萃取法提取黑姜中的姜辣素成分，萃取条件为温度47 ℃、频率25 Hz、压力30 MPa，萃取2 h，最后黑姜姜辣素的含量为2.05%。通过对大鼠腹腔注射2%的四氧嘧啶溶液建立糖尿病大鼠模型，而通过四氧嘧啶建模的大鼠血糖数值相对稳定。将成功建模的大鼠分为模型组、中高血糖组和高血糖组糖尿病大鼠模型。在对模型组自由给水，实验组、对照组灌胃相同量的姜辣素溶液一段时间后，通过对比灌胃前后大鼠血糖浓度变化，发现高血糖组大鼠血糖浓度下降51.9%，中高血糖组大鼠血糖浓度下降69.31%，而对照组的大鼠血糖浓度下降2.35%，其血糖浓度下降并不显著。模型组大鼠血糖值不但没有下降，反而上升了12.97%。综上可以得出黑姜姜辣素对糖尿病大鼠具有显著的降血糖作用，而对正常大鼠几乎没有作用。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对提取得到的黑姜姜辣素进行检测后，共检出100多种物质，而姜辣素的主要成分6-姜酚占总含量的7.21%，姜酮占总含量的4.32%，研究姜辣素的成分对于降血糖药物的研发具有深远意义。