肉桂精油可食性复合膜的抑菌性能研究

黄梓炜，吴雪辉，周悦，蓝小河，张兵

(华南农业大学 食品学院，广州 510642)

肉桂精油是从桂皮、桂枝、桂叶等部位提取的油状液体[1]，其中含有肉桂醛、肉桂醇、桂皮酸等多种重要的活性成分[2]，这些活性物质具有抑菌活性和抗氧化活性[3-4]，使得肉桂精油对多种微生物具有良好的抑菌效果[5-6]。王芳等[7]发现肉桂精油能改变细菌细胞形态，对成团泛菌和腐生葡萄球菌有明显的抑菌作用。Zhang等[8]用肉桂精油作抑菌剂，发现其对菌丝生长、孢子活力和真菌萌发均有明显的抑制作用。

可食性复合膜是指可食性大分子物质与食品添加剂、表面活性剂等经过加工后得到的具有选择透过性的薄膜[9-10]，继续添加天然抗菌植物精油，使之变成具有抗菌作用的复合膜[11]，复合膜能够有效地将植物精油包埋在膜内，控制精油的释放，保留植物精油的抗菌活性[12]。郑玉玺等[13]在可食性复合膜中添加荔枝木质精油后，抑菌活性大大增强，能够有效地抑制革兰氏菌的生长。逯文倩等[14]研究表明牛至精油复合膜可以明显控制双孢蘑菇病原菌数量的增长，从而减少双孢蘑菇因感染细菌导致的腐烂现象。随着复合膜的发展应用，不同精油与复合膜的混合效果成为了研究重点，本试验以肉桂精油复合膜为研究对象，测定肉桂精油复合膜的细菌与酵母菌抑制性能，旨在为复合膜的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料与试剂

肉桂精油：广州百花香料股份有限公司；吐温80、甘油、琼脂粉、酵母提取物、细菌学蛋白胨、无水葡萄糖、氯化钠：均为分析纯。

1.1.2 供试菌种

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：由华南农业大学食品学院微生物实验室提供。

1.1.3 试验仪器

HWS-24恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；85-2恒温磁力搅拌器 金坛市城东新瑞仪器厂；FJ-200高速分散均质机 姜堰市银河仪器厂；101-2A电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；HWS-80智能恒温恒湿箱 上海比朗仪器制造有限公司；BTS-100R恒温摇床 上海精其仪器有限公司；SJ-CJ-1F超净工作台 苏州净化设备有限公司；GI36DWS自动压力蒸汽灭菌器 致微(厦门)仪器有限公司；LBI-300-L生化培养箱 上海龙跃仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 肉桂精油复合膜的制备

以蒸馏水体积为基准配制质量分数为5.0%的氧化羟丙基木薯淀粉溶液，在70 ℃下加热搅拌30 min，使淀粉糊化，冷却至室温后，以淀粉溶液体积为基准加入质量分数为1.0%的甘油和1.0%的吐温80，再加入质量分数分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的肉桂精油，将物料混匀后倾倒于平板玻璃皿中，静置10 min后烘干、揭膜，复合膜于50%的相对湿度和25 ℃的温度条件下平衡48 h，备用。

1.2.2 菌种活化与菌悬液的制备

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种到LB培养基中于37 ℃下培养24 h；将酿酒酵母接种到PDA培养基中于28 ℃培养48 h，进行一次活化；用移液管移取1 mL已活化一次的菌液采用相同条件进行二次活化，之后保存于低温环境中。

1.2.3 肉桂精油对细菌和酵母菌抑菌效果的测定

制作含菌平板，在每个含菌平板中央放置1个已灭菌的直径为6 mm的牛津杯，并向其中滴加10 μL肉桂精油，于对照组加入10 μL无菌水，测量抑菌圈直径，用双倍稀释法测定肉桂精油的MIC与MBC，再根据药物敏感试验判定标准，判定敏感程度[15-16](抑菌圈直径大于20 mm为极敏感，15～20 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，6～10 mm为低度敏感，抑菌圈直径小于6 mm为不敏感)。

1.2.4 肉桂精油复合膜对细菌和酵母菌抑菌效果的测定

向平板中加入100 μL菌悬液，均匀涂布后静置5 min。将复合膜样品裁剪成直径为20 mm的圆形膜片，紫外灭菌20 min，用无菌镊子将样品膜放置于含菌平板中心，静置5 min后进行培养，培养结束后测量抑菌圈直径。

1.3 数据分析

试验重复3次，数据以“平均值±标准偏差”表示，运用Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 肉桂精油对供试菌抑菌效果的分析

肉桂精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母的抑菌效果见图1～图3。

图1 肉桂精油对大肠杆菌的抑菌圈大小Fig.1 Inhibition zone size of cinnamon essential oil against Escherichia coli

图2 肉桂精油对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小Fig.2 Inhibition zone size of cinnamon essential oil against Staphylococcus aureus

图3 肉桂精油对酿酒酵母的抑菌圈大小

由图1～图3可知，对照组a中均未表现出抑菌活性，而在添加了肉桂精油后，3种供试菌平板中出现了不同直径的抑菌圈，金黄色葡萄球菌平板中的抑菌圈直径为(34.28±0.58) mm，大肠杆菌平板中的抑菌圈直径为(26.38±0.51) mm，根据药敏试验标准，肉桂精油对两种细菌均表现为极敏感，能够得出肉桂精油的细菌抑制性强，且对革兰氏阳性菌的抑菌作用优于革兰氏阴性菌。此试验结果与李娜等[17]、Khazaei等[18]研究中肉桂精油对革兰氏菌的抑菌结果一致，这是因为肉桂精油及其疏水性组分可直接作用于磷脂双分子层，阻止酶和蛋白的结合，从而提高了细胞膜的通透性，并引起细胞膜破裂，膜内物外渗，所以起到了抑菌效果[19]。此外，酿酒酵母平板中的抑菌圈直径为(48.07±0.84) mm，也表现为极敏感，表明肉桂精油对酵母菌的抑菌活性优于细菌，在刘笑宇[20]的研究中也得出肉桂精油对酵母菌的抑制作用优于细菌的结论。

肉桂精油对3种供试菌的MIC值和MBC值结果见表1和表2。

表1 肉桂精油对供试菌的MIC值Table 1 MIC values of cinnamon essential oil against tested bacteria

表2 肉桂精油对供试菌的MBC值Table 2 MBC values of cinnamon essential oil against tested bacteria

由表1和表2可知，肉桂精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC值均为0.25 μL/mL，MBC值分别为1，4 μL/mL，两种细菌的MBC值明显大于其MIC值，但酿酒酵母的MIC值和MBC值却相同，且相较于两种供试细菌更低，皆为0.125 μL/mL，表明肉桂精油对酵母菌的抑菌效果更明显。

2.2 肉桂精油复合膜的细菌抑制活性分析

2.2.1 复合膜的大肠杆菌抑菌效果分析

不同质量分数的肉桂精油复合膜对革兰氏阴性的大肠杆菌的抑菌效果见图4。

由图4可知，对照组a中未添加肉桂精油，平板内长满了大肠杆菌，而在添加了不同质量分数肉桂精油的试验组中出现了大小不同的抑菌圈，质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的肉桂精油复合膜的抑菌圈直径分别为(15.26±0.77)，(26.44±0.57)，(34.07±0.40)，(41.61±0.85)，(48.98±0.38) mm，根据药敏试验标准，除了0.5%的肉桂精油复合膜对大肠杆菌表现为高度敏感外，其余均表现为极敏感。

图4 复合膜对大肠杆菌的抑菌圈大小Fig.4 Inhibition zone size of composite film against Escherichia coli

2.2.2 复合膜的金黄色葡萄球菌抑菌效果分析

不同质量分数的肉桂精油复合膜对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌的抑菌效果见图5。

图5 复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小Fig.5 Inhibition zone size of composite film against Staphylococcus aureus

由图5可知，对照组a中未出现抑菌活性，而当复合膜中肉桂精油的质量分数由0.5%增加至1.0%时，抑菌圈直径由(21.55±0.52) mm增大至(29.37±0.43) mm；肉桂精油质量分数为1.5%、2.0%时，抑菌圈直径增大为(38.44±0.44)，(44.76±0.97) mm；当质量分数为2.5%时，抑菌圈直径增大为(54.43±0.74) mm，在药敏试验标准下，肉桂精油复合膜对金黄色葡萄球菌均表现为极敏感。

对比分析图4与图5，在相同肉桂精油质量分数下，复合膜对革兰氏阳性菌的抑制作用优于革兰氏阴性菌，这是因为革兰氏阳性菌的内部结构中仅有单一的肽聚糖层结构，而革兰氏阴性菌是双层的脂质结构，且具有外膜蛋白或细胞壁脂多糖的保护，使得革兰氏阴性菌能够防止多种物质的渗入与透过，所以革兰氏阴性菌对肉桂精油复合膜的耐受程度优于革兰氏阳性菌，抑菌圈更小。

2.3 肉桂精油复合膜的酵母菌抑菌作用分析

不同质量分数的肉桂精油复合膜对酿酒酵母的抑菌效果见图6。

图6 复合膜对酿酒酵母的抑菌圈大小Fig.6 Inhibition zone size of composite film against Saccharomyces cerevisiae

由图6可知，对照组a中无抑菌圈生成，不存在抑菌活性，而当肉桂精油的添加量为0.5%时平板中的抑菌圈直径为(30.52±0.71) mm；肉桂精油质量分数为1.0%、1.5%时抑菌圈直径增大至(38.43±0.86)，(47.62±0.88) mm；当质量分数为2.0%时抑菌圈直径增大至(66.77±1.13) mm，直至质量分数为2.5%时，抑菌圈直径扩大至与平板直径相同，此时的抑菌效果达到最强。根据药敏试验标准，肉桂精油复合膜对酿酒酵母均表现为极敏感，且将试验结果与细菌的抑菌圈试验结果相比较可以得出，在相同的肉桂精油添加量下，复合膜对酵母菌的抑菌活性优于细菌。

3 结论

肉桂精油对3种供试菌具有良好的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母的抑菌圈直径分别为26.38，34.28，48.07 mm，MIC分别为0.25，0.25，0.125 μL/mL，MBC分别为1，4，0.125 μL/mL。肉桂精油复合膜对3种供试菌的抑菌活性强弱顺序与肉桂精油相同，均为酿酒酵母>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌，且随着肉桂精油质量分数的提高，复合膜抑菌作用增强。当肉桂精油质量分数从0.5%增加至2.5%时，大肠杆菌的抑菌圈直径由15.26 mm增大到48.98 mm，金黄色葡萄球菌从21.55 mm增大到54.43 mm，酿酒酵母则由30.52 mm扩大到平板上没有菌生长，得出肉桂精油复合膜能够有效保留肉桂精油的抑菌活性并且有效地抑制微生物的生长，为复合膜的应用提供了参考。