FBXO22在急性髓系白血病中的表达分析

吴冬会，杨艳丽，周黎黎，马 丽，汪 晶，程 阳，徐旺旺，李玉云

急性髓系白血病(AML)为骨髓造血细胞恶性增殖疾病，主要表现为造血系统异常，包括白细胞异常、不同程度贫血、凝血功能障碍，还伴有发热和肝脾淋巴结肿大，以造血细胞分化障碍和造血干细胞/祖细胞无限增殖为主要发病机制，如不及时治疗,可导致病人迅速骨髓衰竭并最终死亡。AML是成人最常见的白血病类型，随着科学研究的不断深入，AML的治疗手段也更加多样化，多种治疗手段相互补充，使AML的治疗水平得到很大提升，但仍然存在不良反应大、微小残留细胞白血病难以根治等难题[1]，仍需继续深入探讨AML的发病机制，为AML的诊疗提供新的思路。FBXO22已被证实参与多种肿瘤的发生、发展和信号转导，但是其在AML病人体内的表达情况和临床作用尚未被阐明。本研究探讨AML病人骨髓细胞中FBXO22 mRNA表达情况及其与病人临床指征的相关关系。现作报道。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年5-12月在蚌埠医学院第一附属医院就诊的AML病人92例。AML病人筛选和分组标准根据《血液病诊断及疗效标准》第四版[2]，排除由骨髓增生异常综合征和骨髓增殖性肿瘤转化的AML。所有研究对象均知情同意。其中初发组41例，男25例，女16例，年龄19～85岁；完全缓解(CR)组28 例，男18例，女10例，年龄15～71岁；部分缓解(PR)组23例，男14例，女9例，年龄25～77岁。另选取同期肾性贫血、缺铁性贫血病人30例作为对照组，男17例，女13例，年龄28～84岁。各组年龄、性别等一般资料均具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 Ficoll试剂购自索莱宝公司(北京)，Trizol试剂和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher公司(美国)，PCR引物由金斯瑞公司合成(南京)，SYBR Premix Dimer Eraser 购自Takara 公司(日本)，全自血液动分析仪购自希森美康公司(日本)，荧光定量PCR仪购自ABI公司(美国)。

1.2.2 骨髓中单个核细胞提取 采集各组病人骨髓血2～4 mL，加入等量PBS洗液混匀，按3∶2延管壁缓缓加入Ficoll试剂，离心，吸取中间白膜层，为单个核细胞，PBS洗涤2次，-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.3 实时荧光定量PCR法测定FBXO22 mRNA相对表达量 用Trizol试剂分离细胞总RNA，检测其浓度和纯度。RNA进行逆转录生成cDNA，再进行定量PCR试验，每个样本平行测定3次。引物序列为GAPDH(F：5′-GGA AGC TTG TCA TCA AT GGA AAT C-3′;R:5′-TGA TGA CCC TTT TGG CTC CC -3′)，FBXO22(F:5′-CGG AGC ACC TTC GTG TTG A-3′;R:5′-CAC ACA CTC CCT CCA TAA GCG-3′)。实验数据采用2-ΔΔCT表示，所得结果表示FBXO22 mRNA相对于内参基因的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用t检验、方差分析、q检验和Pearson相关分析。

2 结果

2.1 各组病人FBXO22 mRNA相对表达量比较 各组FBXO22 mRNA表达水平间差异有统计学意义(P<0.01)，其中PR组和初发组均低于对照组和CR组(P<0.05)，而对照组和CR组、PR组和初发组间差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组病人FBXO22 mRNA相对表达量比较

表2 不同临床指标的初发组病人FBXO22 mRNA相对表达量比较

2.2 不同临床指标的初发组病人FBXO22 mRNA相对表达量比较 不同性别、年龄、贫血程度、白细胞计数、临床分型的初发组病人FBXO22 mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，而不同血小板计数病人的FBXO22 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。相关分析显示，初发组病人血小板计数与FBXO22 mRNA相对表达水平呈明显正相关关系(r=0.492，P<0.01)。

3 讨论

AML是由粒系造血细胞发生不同阶段分化障碍、凋亡受阻以及恶性克隆性增殖而引起的，主要发病机制有融合基因发生、信号通路异常、造血细胞畸变、造血微环境改变，近年新兴治疗药物和治疗手段不断发展，大部分病人病情可得到改善，30.0%～50.0%病人可以痊愈，但仍有约30.0%病人存在临床预后较差，生存期较短，大多只有3～6个月[3]。

蛋白酶体降解系统是各种真核生物体内机体降解蛋白质重要机制之一[4-5]。泛素-蛋白酶体降解途径已被证实参与多种肿瘤疾病发生发展，但其在AML发病过程中所起的作用较少被探讨，其主要由三个关键酶和26s蛋白酶体参与完成[6]。其中泛素蛋白酶体中的一个关键酶——泛素连接酶，能够识别并降解特定蛋白质，FBXO22蛋白属于F-box蛋白家族，它与接头蛋白Skp1、骨架蛋白Cullin、RING锌指蛋白组成泛素连接酶，识别指定目标蛋白质，泛素化的蛋白质再通过与26s蛋白酶体，达到靶向介导蛋白质降解的作用。

本研究采qRT-PCR法检测AML病人和对照组骨髓单个核细胞中FBXO22 mRNA表达差异，发现PR组和初发组均低于对照组和CR组，而对照组和CR组、PR组和初发组间差异均无统计学意义。本研究还分析了初发组病人FBXO22 mRNA相对表达量与相关临床指征关系，结果显示，FBXO22 mRNA相对表达量与血小板计数呈正相关关系。FBXO22被证实与多种调控因子组成信号通路，调控细胞各种生命活动，其上游调控因子有miR-155、p53、TP53和miR-433-3p，下游控制靶点包括KDM4A、 KDM4B、 Methylated p53、p21、 KLF4、 LKB1、CD147、Bach1、PTEN、Snail、HDM2、PHLPP1、TFEB。研究发现，FBXO22在不同系统、组织、器官内参与疾病进程，主要有肿瘤发生、增殖和转移[7-16]，调控细胞生命周期[17]，动态监测神经系统疾病治疗效果[18]，参与细胞自噬调节[19]，逆转肿瘤靶细胞的耐药性[20]等。在消化道肿瘤、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌中，高表达的FBXO22发挥促肿瘤作用，包括导致肿瘤发生，加速肿瘤细胞生长，促进肿瘤向其他组织侵袭、转移等，但是在肾细胞癌中FBXO22却发挥截然相反的作用，低表达的FBXO22与肾细胞肿瘤直径、TMN分期以及较差的预后和无病生存期相关，且FBXO22可以抑制肾癌细胞的迁移和侵袭。此外FBXO22还可不通过蛋白酶体降解途径，直接与丝氨酸消旋酶结合，影响其亚细胞定位，从而促进D-丝氨酸合成[21]。对于儿童AML，姜艳红等[22]证实血小板不减低对初发儿童AML的治疗起保护作用并且预后良好。对于成人AML，有研究[23]发现AML治疗后血小板升高是提示肿瘤细胞解除抑制正常造血重要指征，是观察治疗效果的重要因素。向丹等[24]试验发现，血小板动态监测在白血病的治疗和良好预后发挥一定作用，且化疗后血小板增多是AML治疗取得预后良好的重要标志。

综上，AML病人骨髓细胞FBXO22基因表达水平降低，且其表达与外周血血小板计数呈正相关关系，而FBXO22如何在分子水平调控AML的发生发展，以及FBXO22如何调控血小板的生成，仍需进一步研究探讨。