镉胁迫下EDTA对猴头菇液体培养菌丝生理活性的影响

王佩茵 徐亚幸 许晓婷 吴映明

（广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州 510303）

猴头菇Hericium erinaceus，属猴头菌科，猴头菇属，是一种药食两用菌，具有巨大的潜在研究价值[1−2]。当下环境镉污染严重，镉易通过栽培料影响食用菌的正常生理生化，不利于食用菌产业的绿色发展，亦会通过食物链进入人体进而威胁人类健康[3−4]。乙二胺四乙酸（EDTA）是一种能够与重金属离子形成稳定络合物的螯合剂。研究表明EDTA 可有效缓解重金属对生物的毒害[5−8]，但将EDTA 应用于缓解食用菌重金属胁迫的研究较少，且现有研究多以子实体为试材[9−10]，存在研究耗费时间长的缺点。试验利用EDTA 螯合猴头菇培养液中的镉离子，采用液体培养的方式制备粗酶液检测其生理活性，探索一种降低猴头菇对镉吸收的生产方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试猴头菇菌株

猴头菇菌株（GDMCC 5.207），由广东省微生物研究所提供。

（2）试剂与仪器设备

①试剂：四水合酒石酸钾钠（分析纯，广东广试试剂科技有限公司），3，5−二硝基水杨酸（DNS）（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），羧甲基纤维素钠（CMC−Na）（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），2，2′−联氮−双−3−乙基苯并噻唑啉−6−磺酸（ABTS）（化学纯，上海麦克林生化科技有限公司），硝酸镉（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙二胺四乙酸二钠（EDTA−2Na）（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；②仪器设备：FA1004 电子天平（上海越平科学仪器有限公司），WPX−9252 精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），YXQ−LS−75G 立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），CHA−S 气浴恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司），KH−45 A 电热恒温干燥箱（康恒仪器有限公司），UV−1500 紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）。

（3）培养基：PDA 平板培养基为马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 7~8；液体培养基为马铃薯200 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1 g，水1 000 mL，pH 7~8。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

挑取猴头菇菌丝转接至PDA 平板培养基，28 ℃恒温培养20 d。

1.2.2 EDTA调控处理方法

液体培养基中加入20 mg/L 硝酸镉，根据预试验结果，设定 5 个 EDTA 处理（0、10、20、40、80 mg/L），以不添加镉及EDTA 的液体培养基培养的液体培养菌丝为空白对照。挑取已活化的1 cm2的菌丝圆片3 块接至各试验培养基中（125 mL/250 mL），28 ℃，150 r/min 振荡培养，6 个处理各设置12个重复。

1.2.3 样品制备

接种后培养4 d、8 d、12 d、16 d，然后分别在各处理中随机取3 个重复样品，拍照记录菌丝球生长情况；真空抽滤收集母液及菌丝体，菌丝体68 ℃恒温烘干至恒重，称干重。母液经3 500 r/min 离心10 min，提取上清液即为粗酶液。

1.2.4 酶活性测定

羧甲基纤维素酶（CMC 酶）活性，采用3，5−二硝基水杨酸比色法[11]，于520 nm 波长处测定，葡萄糖回归方程为y=6.5857x−0.0156；漆酶活性，采用ABTS 法[12]测定，于410 nm 处测定。定义每分钟使OD 均值增加0.1 所需要的酶量为1 个酶活性单位（U）；淀粉酶活性参考朱启忠[13]3，5−二硝基水杨酸比色法于540 nm 处测定，葡萄糖回归方程为y=4.92x−0.0107。

1.3 数据处理与分析

采用EXCEL 2018和SPSS 26.0对试验数据进行方差分析及差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 EDTA 对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝液体培养特征的影响

培养液颜色越浅，浑浊度越低，菌丝球体积越大，表明菌丝生长发育越旺盛，对培养液中碳氮源的水解越充分[3]。试验培养16 d 时观察猴头菇液体培养菌丝特征如图1。由图1 可知，随EDTA 质量浓度上升，猴头菇菌丝球体积明显增大，培养液由橙黄色变为淡黄色，由此可知，EDTA 能促进Cd2+胁迫下猴头菇菌丝对胞外物质分解利用。40 mg/L EDTA 处理组菌丝球体积大于其他各处理组，与空白组相近，且培养液清晰度最高、颜色最浅，表明40 mg/L EDTA 对Cd2+抑制菌丝生长的缓解效果最好，且对培养液营养物质的利用好于空白组，其菌丝生长发育状态更佳。

图1 试验各处理猴头菇液体培养菌丝特征（培养16 d，数字为Cd2+质量浓度mg/L）

2.2 EDTA 对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝球干重的影响

由图2可知，液体培养基接种培养8 d内各处理组菌丝干重无显著变化，培养12 d，空白组及40 mg/L、80 mg/L EDTA 处理组菌丝干重显著上升，其他处理组的菌丝干重均无明显上升。EDTA 各处理组的峰值出现在培养16 d，仅添加Cd2+的处理组菌丝干重显著小于其他处理组（P<0.05）；向含Cd2+的培养液加入EDTA 后，菌丝干重随EDTA 质量浓度的升高先上升而后降低，40 mg/L EDTA 处理组菌丝干重最高（P<0.05），各处理组的菌丝干重均小于空白组。

图2 EDTA对Cd2+胁迫下猴头菇液体培养菌丝球干重的影响

2.3 EDTA 对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外羧甲基纤维素酶活性的影响

由图3 可知，EDTA 能提高Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外羧甲基纤维素酶（CMC）活性，随液体培养时间的延长，除10 mg/L EDTA 处理外，其他处理组的CMC 活性先升后降，并于接种后培养8~12 d出现峰值，这与前人研究香菇[14]和蟹味菇[15]的菌丝对纤维素的利用晚于淀粉的结果较一致。培养液加Cd2+后（图3 中Cd−EDTA 0）猴头菇菌丝的CMC 活性显著 低 于 空 白 组（P<0.05），其 中 EDTA 20 mg/L、40 mg/L 处理组表现出较高酶活性，并以40 mg/L 处理组对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝CMC 活性的促进作用最为显著（P<0.05）。

图3 EDTA对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外羧甲基纤维素酶活性的影响

2.4 EDTA 对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外漆酶活性的影响

由图 4 可知，除添加 0 mg/L、10 mg/L EDTA 处理组外，其他处理组的猴头菇菌丝体胞外漆酶活性均于接种后培养12 d 出现峰值，这与前人研究杏鲍菇[16]和金针菇[17]的结果相似，说明猴头菇菌丝对木质素的利用最迟。仅加硝酸镉的对照组（图4 Cd−EDTA 0）菌丝漆酶活性明显低于空白组（P<0.05），且随培养时间的延长，菌丝漆酶活性无明显变化。除EDTA 10 mg/L 处理外，其他处理组均能显著提高Cd2+胁迫下的菌丝漆酶活性（P<0.05）；EDTA 20 mg/L、40 mg/L 处理能明显促进菌丝漆酶活性，且以EDTA 40 mg/L 处理在接种12 d 时的漆酶活性最高，说明40 mg/L EDTA 处理组促进猴头菇菌丝对培养液中木质素物质的降解利用。

图4 EDTA对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外漆酶活性的影响

2.5 EDTA 对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外淀粉酶活性的影响

由图5 可知，各处理猴头菇菌丝体胞外淀粉酶活性均在培养前期迅速升高，接种后培养4 d 达最高，与前人研究香菇[14]、金耳[18]的菌丝在培养初期可能利用淀粉为先的结果较一致。与空白组比较，Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体淀粉酶活性下降，EDTA 40 mg/L 处理菌丝体的淀粉酶活性最高（2.48 U/mL），显著高于其他处理（P<0.05）；EDTA 10 mg/L 及EDTA 80 mg/L 处理对菌丝体淀粉酶活性影响不明显（P>0.05）；EDTA 20 mg/L、EDTA 40 mg/L处理菌丝体的酶活性均高于对照组，其中以EDTA 40 mg/L 处理促进猴头菇菌丝体淀粉酶活性最为显著。

图5 EDTA对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝体胞外淀粉酶活性的影响

3 小结与讨论

食用菌菌丝体胞外酶活性的变化与其生长发育直接相关，如果菌丝体胞外酶活性降低，会阻止食用菌对营养物质的吸收利用，影响食用菌正常代谢，降低食用菌产量及品质。刘秋梅等[3]研究发现，随培养液中镉含量的升高，食用菌菌丝体胞外酶活性及菌丝球生物量降低。施加外源物是缓解生物重金属毒害的有效途径，王芳等[19]研究表明，一氧化氮能缓解镉胁迫对玉米生长的抑制作用；佘婷婷等[20]研究表明，外施SA（水杨酸）能显著提高Hg 胁迫下金针菇的胞外酶活性。笔者研究表明：EDTA对Cd2+胁迫下猴头菇菌丝生长量、淀粉酶性、漆酶性、CMC 活性有重要影响；EDTA 40 mg/L 处理，猴头菇液体培养菌丝生长状态最佳、胞外酶活性最高，且胞外淀粉酶、CMC 活性均高于空白组。由此得出，该质量浓度EDTA 可有效缓解Cd2+对猴头菇菌丝的毒害，促进菌丝生长及胞外酶活性。