噬菌体在结直肠癌中的研究与应用进展

郑书娟，肖建辉

(遵义医科大学附属医院，遵义市医药生物技术重点实验室，贵州 遵义 563099)

结直肠癌，又称大肠癌，是全世界发病率和死亡率较高的癌症之一。结直肠癌的发病原因与环境、生活方式、遗传因素等有一定关联，但确切病因尚无定论。随着对肠道微生物研究的深入，科学家们已证实肠道微生物与结直肠癌的发生发展存在内在联系[1]。结合当前粪菌移植的临床研究进展，通过靶向改变肠道微生物区系结构可能对结直肠癌的预防、治疗有积极作用。噬菌体是一类侵袭细菌、真菌等微生物的病毒，是地球上最高丰度的生物体[2]。噬菌体是调节细菌群落的重要参与者，它通过一个复杂的“捕食者-猎物”策略，调整微生态系统的平衡。因此，噬菌体具有用来裂解肠道菌群中有害菌，重塑肠道菌群结构的潜在价值。尤其是针对结直肠癌发生发展的相关肠道菌群，借助特定噬菌体有可能起到积极的预防和治疗作用。为此，本文搜集了近年来有关噬菌体与结直肠癌的相关文献，就噬菌体的功能及其与细菌间的相互作用、肠道噬菌体在结直肠癌发生发展中的作用、特异性噬菌体在结直肠癌中的应用等3个层面进行了综述，为结直肠癌防治提供新思路。

1 噬菌体的功能与细菌之间的相互作用

众所周知，噬菌体必须在活菌内寄生，且有严格的宿主特异性，只侵染特定类型细菌，一般不攻击正常细菌和人类细胞。依据噬菌体的繁殖特点将其分为毒性噬菌体和温和噬菌体，毒性噬菌体在宿主菌体内复制繁殖，产生许多子代噬菌体并最终裂解细菌。当今，被称为抗生素耐药时代，应对抗生素耐药刻不容缓。利用毒性噬菌体这一特性，替代抗生素或与抗生素联合用药抗击耐药细菌有积极意义[3]。温和噬菌体感染宿主后若进入溶原性周期，则暂时不产生子代噬菌体，而是将其基因整合于宿主细菌染色体上(即前噬菌体)，随着宿主菌染色体的复制而复制，并随细菌分裂而进入子代细菌中，但在某些理化因素刺激下，前噬菌体会脱离宿主菌染色体进入溶菌性周期，导致细菌裂解并释放子代噬菌体。

噬菌体以细菌作为宿主进而“杀死”细菌这一特性，引起研究者们极大兴趣，寻找可裂解有害菌的特异性噬菌体类群，用于清除体内有害菌从而使病情得到缓解。不过，在噬菌体侵染时，细菌具有相应的保护和抵抗机制[4]。譬如，细菌改变其表面受体，从而防止噬菌体吸附[5]；细菌体内的Abi系统阻止侵入的噬菌体繁殖[6]；细菌基因组中的限制修饰系统可以区别自体和异体DNA，可用来清除噬菌体DNA等[7]。同时，噬菌体针对细菌的抵抗亦积极应答。譬如，与细菌受体结合的噬菌体受体结合蛋白发生突变，以适应细菌受体的改变[8]。

值得注意的是，噬菌体与细菌相互作用还表现在两者基因组整合后，噬菌体可将整合的耐药基因转运到其它细菌，使后者获得抗药性。Modi等[9]用抗生素治疗小鼠8周后检测小鼠粪便中噬菌体，与对照组相比，抗生素处理组的肠道噬菌体基因组中携带更多的细菌耐药基因，甚至存在与所使用药物无关的耐药基因。而且，将这些噬菌体添加到未用抗生素处理的肠道菌中，致使这些肠道菌的抗药性增加数倍。因此，噬菌体在这里扮演了耐药菌同盟军的角色，帮助细菌获得耐药性。这些结果提示，以肠道噬菌体为靶标可能是延缓细菌产生耐药性重要新途径。

噬菌体不仅可以裂解宿主菌，还可以随着宿主菌的转移进入新的环境继续存活、繁殖发育和发挥作用。近年来有研究表明婴儿肠道存在的双歧杆菌群落是通过母乳垂直传播的，且发现双歧噬菌体通过以双歧杆菌作为宿主也可以母乳垂直传播的方式传递给婴儿[10]，这一发现不仅支持婴儿肠道菌群一部分来自母乳的观点，而且说明噬菌体在宿主菌周围环境变化后仍可繁殖发育，且噬菌体的存在可能在婴儿肠道微生态的形成中有着至关重要的作用[11]。

2 肠道噬菌体在结直肠癌发生发展中的作用

结直肠癌的病因学调查发现，结肠息肉恶变、结肠粘膜慢性炎症刺激、饮食习惯和遗传等因素与疾病的发生有一定关联，且属高危因素。但从循证医学角度看，它们仍然缺乏直接的病因学证据。近些年来，肠道菌群、肠道噬菌体的研究取得积极进展，观察到它们结构组成的改变对病情发生发展有重要影响，尤其是肠道噬菌体与结直肠癌的关系值得关注。

噬菌体有增强细菌生物膜的功能或者自身具有类似合成生物膜的能力[12]，而生物膜可以通过恶化肠道炎症状态、促进活性氧产生等影响癌症的发生发展[13]。因此，研究者提出了“噬菌体裂解细菌-细菌死亡-细菌成分形成生物膜-有害菌(如具核梭杆菌)定居-影响宿主”这一模型[14]。对于噬菌体如何影响细菌群落进而导致疾病发生这一问题，有研究者在一项小鼠的体内实验中找到了可能的答案[15]。他们通过在无菌小鼠中定植人类肠道共生细菌，给药(裂解噬菌体)后观察到肠道中裂解噬菌体可与宿主菌共存并降低其丰度，进而影响肠道中非宿主菌的丰度，改变肠道微生态系统细菌群落的组成，并影响肠道细菌色胺、酪胺等代谢产物的产生。细菌代谢产物是细菌与哺乳动物宿主沟通的重要信号分子，若代谢产物发生改变，对宿主存在潜在的影响并导致相关疾病的发生。不过，该研究所使用的噬菌体是裂解性的，而人体肠道噬菌体主要是温和噬菌体，后者只会在特定理化因素的作用下裂解宿主菌。

在结直肠癌患者中，肠道噬菌体的丰富度和多样性显著增加[16]，其以Siphoviridae，Myoviridae和Podoviridae最具代表性，其中35.7%的肠道噬菌体以大肠杆菌作为宿主，而且53.6%的肠道噬菌体已在原发性结直肠癌病灶中被发现[17]，这些结果提示肠道噬菌体可能参与了结直肠癌疾病的进程，但肠道噬菌体与结直肠癌发生发展是否存在因果关系尚需进一步研究。近来，Hannigan等[18]报道了噬菌体与结直肠癌之间可能的关系，其发现与结直肠癌相关的病毒主要来自Siphoviridae和Myoviridae家族的噬菌体以及其它未被鉴定的噬菌体，且噬菌体被证明在微生物群落的调节中起关键作用，通过噬菌体与细菌群落间相互作用，影响菌群和噬菌体的组成和丰度，从而间接地促进结直肠癌发生发展，致使病情恶化。因此，肠道噬菌体的改变有可能促进结直肠癌的发展。但是，由于噬菌体和细菌之间是互作的，所以仍需进一步研究是细菌群落改变了噬菌体，还是噬菌体改变了细菌群落。

人体肠道内有高达14万种可以感染细菌的噬菌体[19]，噬菌体侵入细菌后繁殖，并在一定条件下裂解宿主细菌，而肠道细菌与生命体共生并参与机体代谢、影响机体免疫等。因此，虽然现有报道支持噬菌体在结直肠癌中具有直接或间接作用，但噬菌体和结直肠癌的相关研究不够深入，尚有诸多亟待解决的问题，如两者之间的因果关系尚无定论、噬菌体丰富度和多样性的改变究竟是由何种原因引起，以及噬菌体自身是否对疾病有直接影响等。另外，某些病毒已被证明与癌症种类的病因关系，如EB病毒、HPV分别是鼻咽癌、宫颈癌的主要致病因素。人体中的噬菌体等病毒种群和数量远远多于细菌，其扮演的角色可能更复杂。总之，肠道噬菌体在调节肠道菌群结构与丰度方面扮演了重要角色，且对结直肠癌的发生发展存在重要影响，但究其作用机制以及病因学方面尚待深入研究。

3 特异性噬菌体在结直肠癌中的应用

3.1 噬菌体检测在结直肠癌筛查中的潜在价值 随着结直肠癌发病率的升高，发现有效的结直肠癌标志物至关重要。就现有的报道来看，噬菌体除了影响疾病的发生发展外，也具有作为疾病早期筛查或诊疗标志物的潜力。结直肠癌患者的肠道病毒组会发生改变，可能会形成特定的病毒类群。基于此，我们可以将发生改变的特定病毒类群作为一种预测疾病发生或者恶化的标志物。已有的研究结果提示，结直肠癌患者中细菌种类减少，病毒种类增加，其中噬菌体是主要的病毒种类(46%)，根据病毒和细菌种类的香农指数应用Hutcheson t检验可以区分原发性结直肠癌、转移瘤和正常组织[17]；此外，有研究者筛选出22个病毒标志物(贡献最大为Orthobunyavirus，其次是Inovirus和Tunalikevirus)，借助这22个病毒标志物标记不仅可以提高粪便潜血实验对于结直肠癌的检出率，还可以将结直肠癌早期与晚期患者区分开来。此外，该研究组还采用4个病毒标志物组合(Betabaculovirus，Epsilon15likevirus，Mulikevirus和Punalikevirus)确定了具有高死亡风险的患者，以及在调整混杂因素后病毒组具有预测疾病预后的潜力[16]。在最新的报告中，研究者基于中国香港、奥地利萨尔茨堡和日本东京的3个队列317个宏基因组样本，通过随机森林模型发现了结直肠癌中富集的5种肠道噬菌体标志物(Peptacetobacterhiranonis噬菌体，Fusobacteriumnucleatumanimalis7_1噬菌体，Fusobacteriumnucleatumpolymorphum噬菌体，Fusobacteriumnucleatumanimalis4_8 噬菌体和Parvimonasmicra噬菌体)。使用这5种噬菌体标志物可以区分患者和对照组，且受试者工作曲线(AUC)下面积为0.861 6，而AUC越接近1表明检测方法真实性越高，使用中国海南和意大利米兰的样本进行验证，AUC为0.819 7。另外，该组合可以较好的区分结直肠癌和溃疡性结肠炎患者(AUC为0.780 2)[20]。以上研究表明，使用噬菌体作为结直肠癌的诊断标志物是可行的，若能将筛选出的病毒标志物与其它检测方法联合应用，或许可以用来提高结直肠癌的检出率和早诊率，起到预防和早诊早治的作用。

3.2 靶向有害菌 在结直肠癌的发生发展过程中，除了病毒(噬菌体)会发生改变以外，肠道细菌也会发生改变，其中与结直肠癌发生密切相关的细菌有具核梭杆菌[21]。在结直肠癌的化疗研究中发现，具核梭杆菌可以帮助癌细胞抵抗药物，其通过协调Toll样受体、microRNAs和自噬的分子网络，导致针对结直肠癌的化疗效果不佳[22]。并且，有研究证明具核梭杆菌的增加在多种疾病的发生中起到促进作用[23]，如口腔疾病、炎症性肠病、Lemierre综合征等。因此，具核梭杆菌成为这些疾病的一个治疗靶标，研究控制其丰度的有效策略极有研究价值，而针对具核梭杆菌的噬菌体是可能取得重要突破的途径。目前针对具核梭杆菌，已有研究证实了噬菌体治疗的安全性和有效性[24-25]。

FNU1是一种新型的特异性抗具核梭杆菌的噬菌体，该噬菌体基因组与已知的噬菌体基因组几乎无同源性，但在其基因组开放阅读框中也发现了防御细菌抗噬菌体系统的基因，如甲基化基因、防止Abi的基因等。实验证明FNU1可以破坏具核梭杆菌70%的生物膜并破坏膜内细菌，且相比于抗生素的无差别“大面积杀伤”，FNU1的宿主菌只有具核梭杆菌，专一性、靶向性极强[26]，因此治疗时不用担心会破坏机体肠道的正常菌群。但该研究尚未进行体内实验，给药方式也是根据先前的实验提出可以制成栓剂、含片等剂型。M13是一株通过噬菌体展示技术筛选出的与具核梭杆菌特异性结合的噬菌体。将M13表面衣壳蛋白与银纳米颗粒组装(银纳米粒子也具有杀伤具核梭杆菌的效果)，实现了细菌的高效裂解，并在体内重塑了肿瘤免疫微环境[27]。体内外研究均表明，组装后的噬菌体可以有效地清除肠道中的具核梭杆菌，并导致肿瘤部位的免疫抑制髓系衍生细胞扩增减少，同时M13噬菌体作为一种细菌病毒可以激活抗原提呈细胞，进一步改变抑制性的肿瘤免疫微环境，且在动物模型中，结合免疫检查点抑制剂或化疗药物可以进一步显著提高治疗效果和总体存活时间[27]。而噬菌体成功进入体内定植后还需考虑以下几点：首先是噬菌体复制后的剂量。噬菌体在宿主菌中可以自我复制，但复制后的剂量是无法控制的[28]；随着宿主菌的裂解死亡，噬菌体也会随之减少，但从细菌裂解释放噬菌体到噬菌体减少的这段时间里，需要注意是否会对人体产生危害；其次，噬菌体裂解细菌的过程中可能会释放细菌毒素等物质，尤其是革兰氏阴性菌细胞壁的内毒素[29]；最后，细菌对噬菌体感染产生的获得耐药性[30]。

噬菌体除了可以直接作用于具核梭杆菌，利用其作为载体运送抗菌药也是一种方法[31]。随着结直肠癌的发生，产生丁酸的细菌如酪酸梭菌减少，而丁酸属于短链脂肪酸，短链脂肪酸已被证明可以抑制结直肠癌的生长并诱导抗肿瘤免疫[32]。因此，有研究者使用葡聚糖(在短链脂肪酸形成中有促进作用)纳米颗粒包裹伊利康唑(IDNPS)，再将偶氮化物修饰的IDNPs(D-IDNPs)与叠氮修饰的特异性噬菌体在体内通过生物正交反应连接[31]。因噬菌体可以在肿瘤组织中积聚，随后通过化学反应使D-IDNPS也可在肿瘤中积累，所以与其他实验组相比，噬菌体-D-IDNPS治疗组中小鼠体内的肿瘤体积较小，同时还发现有利于产丁酸细菌的生长和抑制具核梭杆菌的增殖。相比于直接使用噬菌体消灭有害菌，这种方法更好，因为其既促进了有利菌的生长又降低了有害菌的丰度，同时还减少了化疗带来的副作用。

3.3 肿瘤免疫-靶向癌胚抗原 癌胚抗原(CEA)是一种肿瘤相关抗原，存在于由内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，在正常细胞中低表达。以往CEA被选为结直肠癌的特异性标志物，但随着对CEA的研究深入，发现其数值不仅在胃肠道肿瘤中升高，还在肺癌、乳腺癌等疾病中升高，因此目前它被视为一种广谱的肿瘤标志物。有意思的是CEA已被证明可以促进结直肠癌多种恶性特征的发生，如促进肿瘤进程和转移[33-34]，具有作为癌症免疫治疗抗原的潜力。

在一项基于肿瘤免疫的研究中，研究者利用靶向CEA的噬菌体(M13噬菌体)对结直肠癌小鼠进行瘤内和全身给药，结果发现两种给药方式均可以抑制肿瘤细胞的生长，而且瘤内注射还可促进中性粒细胞、巨噬细胞的肿瘤浸润[35]。CEA特异性M13噬菌体抑制肿瘤的机制可能是通过CD8+T细胞(细胞毒性CD8+T细胞可以识别和破坏肿瘤细胞)介导的[35]。随着粪便化学检验等方法的推广，结直肠癌早期发现率越来越高，但不少患者确诊时已处于晚期，且一般伴随肿瘤的远处转移。因此，针对已发生远处转移的结直肠癌患者是否仍可以采用靶向CEA的噬菌体治疗，值得进一步研究。

此外，与结直肠癌有关的肿瘤相关抗原除了CEA以外还有上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)[36]、肿瘤相关糖蛋白72 (TAG-72)[37]等。它们不仅可以作为结直肠癌的诊断标志物，还可通过抑制其表达来抑制癌细胞的增殖[38]，具有作为结直肠癌潜在的治疗靶点。因此，若能利用这一特性将其与特异噬菌体联合应用，将可以为结直肠癌的防治提供一种新的选择。

3.4 基因治疗-靶向结肠癌细胞 点突变、原癌基因激活、抑癌基因功能缺失等都有可能导致癌症，若能对改变的基因进行修正，便可以预防癌症的发生[39]。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的[40]。基因治疗包括突变基因纠正、前药治疗、免疫治疗等[41]。前药治疗又称自杀基因治疗，癌细胞被转导一种自杀酶基因，随后无毒的前药在自杀酶的作用下生成导致癌细胞死亡的物质，如胞嘧啶脱氨酶(CD)将无毒的前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为有毒的5-FU，最后表达CD的癌细胞会被5-FU直接杀死[42]。不过，癌细胞周围不表达CD的细胞也会被杀死(旁观者效应)[43]。

由于前药转化为有毒物质后生物利用度受到了限制，所以目前使用具有直接抗肿瘤作用的编码细胞毒蛋白的基因，如噬菌体ΦX174的毒性E基因，其可以抑制结肠癌细胞的增殖[44]，且该基因不需要前药诱导细胞死亡。噬菌体E基因具有抗肿瘤活性但是缺乏肿瘤特异性。为此，一个研究组使用肿瘤特异性的启动子(CEA启动子)与噬菌体E基因结合，并在转染后的人和小鼠的结肠癌细胞中均检测到E基因的表达，癌细胞的生长也受到抑制，并且在小鼠体内发现肿瘤的体积显著减小，转染后在小鼠中也无毒性作用，但与对照组相比，转染组并未提高小鼠生存率[45]。因此，将肿瘤特异性的启动子与治疗基因结合，便可将治疗基因表达于特定肿瘤，从而发挥抗肿瘤的作用。不过，究竟是什么原因导致生存率未提高，尚待进一步研究。

以上方法中，如利用噬菌体裂解有害菌、使用噬菌体作为载体运送药物等，均没有以改变肠道噬菌体为导向的研究，虽然目前对肠道噬菌体在结直肠癌发生发展中相关作用的认识处于起步阶段，但已证实噬菌体可以通过影响肠道细菌群落间接导致疾病的发生，若能通过重塑肠道噬菌体的结构来改变肠道菌群结构与丰度，或许可以达到预防或治疗结直肠癌的目的。总之，我们应该对肠道噬菌体给予更多的重视，对疾病中肠道噬菌体的改变和两者的因果关系进行深入研究，这将有利于加深对结直肠癌发生发展的认识，从而构建更积极有效的防治策略。

4 展望

目前，随着各种组学技术的发展进步，人们对肠道微生物研究越来越深入，肠道噬菌体作为肠道微生物组的重要组成部分，且作为肠道菌群的重要调节者，其理应成为重要研究对象和相关疾病防治的突破口。一方面，噬菌体治疗作为老方法新利用的代表，在涉及针对结直肠癌等肿瘤耐药性的治疗中具有重要应用前景。另一方面，肠道噬菌体可以影响肠道菌群结构与丰度，进而影响结直肠癌的发生发展，通过重塑肠道噬菌体的结构是否能达到预防或治疗结直肠癌的目的，值得深入研究。此外，有研究者发现在炎症性肠病中细菌和病毒之间存在反向关系，指出分析不同疾病中细菌菌群的变化可能需要同时分析病毒的组成，并强调疾病中噬菌体的改变相对于细菌的改变来说可能更为重要[46]。所以，在有关肠道微生物与疾病的研究中，不能仅仅关注细菌对疾病的影响，而应结合细菌与病毒(噬菌体)等一起研究。总之，随着噬菌体与疾病的关联被越来越多的人发现，噬菌体也许将成为结直肠癌防治的重要突破口。