外周血细胞在PD-1/PD-L1抑制剂治疗中的预测价值

陈静利综述，刘义冰审校

0 引 言

全球癌症统计报告显示，2020年恶性肿瘤的发病率较2018年明显升高，其中我国癌症发病和死亡总数占全球总数的23.7%和30.2%；恶性肿瘤的患病率亦逐年上升，预计至2040年，全球癌症负担将达到2840万例，比2020年增加47%[1]。大多数肿瘤患者以晚期就诊，错失根治治疗的最佳时机，只能采用放、化疗为主的姑息治疗，但最终耐药，预后较差。伴随着帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等PD-1/PD-L1抑制剂等临床研究相继探索出，其单独应用或联合传统治疗等，较传统治疗明显改善患者预后。虽现在已进入“免疫元年”，但PD-1/PD-L1抑制剂(immune checkpoint inhibitor, ICI)在大多数癌症类型的应答率仍低于40%[2]，提示其并非抗肿瘤的“万金油”，具有特定使用人群，目前临床常用筛查指标，主要是检测PD-L1表达、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden, TMB)、微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)等，但因具有取材不便、价格昂贵等缺点，急需更多指标预测ICI疗效，本文就外周血细胞在ICI治疗中的预测价值及外周血细胞与肿瘤微环境的相关性作一综述。

1 ICI治疗作用机制

研究发现，机体杀伤肿瘤细胞，主要通过肿瘤免疫循环途径，其大致包括七步：①肿瘤细胞产生的抗原被树突状细胞(dendritic cells, DCs)加工，②DCs将主要组织相容性复合体I(major histocompatibility complex Ⅰ,MHCⅠ)和MHCⅡ分子上捕获的抗原呈递给T细胞，③效应T细胞反应的启动和激活，④激活的效应T细胞运输至肿瘤病灶，⑤效应T细胞浸润肿瘤，⑥通过T细胞受体(TCR)、及PD-1等黏附分子识别、结合肿瘤细胞，⑦杀伤癌细胞，凋亡的癌细胞释放肿瘤相关抗原进入①，增加后续循环中反应的广度和深度[3]。其中PD-1主要表达于活化的T细胞表面，正常情况下，PD-L1主要由T细胞和B细胞、DCs、巨噬细胞的细胞表达[4-6]。在肿瘤组织中，肿瘤微环境局部释放的炎症因子可促进肿瘤细胞、造血细胞PD-L1高表达，PD-1与PD-L1结合可导致活化的T细胞处于“休眠状态”，不能杀伤癌细胞。ICI的作用机制主要是阻断肿瘤组织内PD-1与PD-L1结合，使先前活化T细胞恢复效应功能，杀伤肿瘤细胞[7]。目前11种ICI药物于国内批准上市，包括8种作用于PD-1靶点的药物:纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumb)、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、派安普利单抗、赛帕利单抗；3种作用于靶点PD-L1的阿替利珠单抗、恩沃利单抗和度伐利尤单抗。目前在临床上已用于多个癌种，具有较好的疗效，但仍有部分患者治疗效果欠佳[8]。

2 外周血细胞水平对ICI治疗的预测价值

2.1 中性粒细胞(Neutrophils)中性粒细胞是外周血白细胞中数量最多的一种，是全身和局部炎症过程的关键介质，经肿瘤细胞释放的CXCL2、CXCL5等趋化因子诱导进入肿瘤微环境中[9]。为响应肿瘤内局部炎症变化，中性粒细胞全身性地扩增，研究发现循环中性粒细胞数量增加与可溶性白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)和IL-17A细胞因子的增加呈正相关，在肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中，中性粒细胞负荷的增加还与细胞毒性 T 细胞标志物的表达降低相关[10]。进入肿瘤微环境的肿瘤相关中性粒细胞(tumor associated neutrophils, TAN)，分为两种类型，包括N1 TAN、N2 TAN，前者通过直接或间接的细胞毒性发挥抗肿瘤活性，后者通过细胞因子和趋化因子的释放来刺激免疫抑制[11]。TAN的表型具有可塑性，研究发现在小鼠和人体中I型干扰素(interferon, IFN)可将中性粒细胞表型改变为抗肿瘤表型，在没有IFN-β的情况下，表现为促肿瘤特性[12]。在TME中N2 TAN发挥重要的抗肿瘤作用，包括释放基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9, MMP-9)促进血管生成、释放的MMP-9等的其他酶降解细胞外基质调节肿瘤的迁移和侵袭、促进肿瘤细胞的增殖、释放出大量细胞因子，作用于不同细胞类型，产生免疫抑制作用[13-14]。

体外培养人外周血中性粒细胞和胰腺导管腺癌细胞系,ELISA结果发现，中性粒细胞分泌大量TNF-α和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可增加胰腺导管腺癌细胞的转移[15]。理论分析，外周血中较高的中性粒细胞可能提示恶性肿瘤预后不良。在肝癌患者手术、局部治疗预后相关性研究中发现，基线中性粒细胞 ≥3100×106/L不仅与总生存期(overall survival, OS)降低相关，还与高肿瘤负荷、血管侵犯、肝外转移和甲胎蛋白水平存在显著相关性[16]。

外周血中性粒细胞数目也与ICI治疗预后相关。一项回顾性单中心分析，纳入接受单药PD-1抑制剂作为二线以上治疗的154例晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者，发现在基线、第二和第三周期免疫治疗时，绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil counter, ANC)升高是无进展生存期(progress free survival, PFS)的独立阴性预后因素，且与更差的 OS 相关[17]。在接受 nivolumab 作为晚期 NSCLC的二线治疗中发现，较低的绝对中性粒细胞计数(<5840/L)OS 和 PFS 显着改善[18]。基线ANC浓度高，提示ICI治疗预后差，但在另一项纳入32名经ICI治疗的转移性NSCLC患者的回顾性队列研究中，认为基线ANC没有任何预后价值，仅可预测ICI治疗的反应，ANC≤4200/mm3的患者更可能产生反应[19]。但该研究所纳入的样本量较少，不能排除存在误差，需扩大样本量后再行验证。

2.2淋巴细胞(Lymphocyte)淋巴细胞在肿瘤免疫循环中发挥核心作用，主要包括T淋巴细胞，B淋巴细胞，自然杀伤细胞。B细胞、NK细胞在骨髓中发育成熟后，释放至外周血，继而到达外周免疫器官；T细胞是骨髓中的始祖T细胞进入胸腺发育为初始T细胞后，随外周血至外周免疫器官，当固有免疫细胞提呈抗原给淋巴细胞后，诱导其进入TME中杀伤肿瘤，其中发挥杀伤力的细胞为CD8+T淋巴细胞[3]。在TME中还有另一种丰富的淋巴细胞为调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)，与肿瘤进展、侵袭性以及转移相关，发挥免疫抑制作用，这种细胞的显著特征是转录因子Foxp3的表达[20]。研究发现，在众多种类的淋巴细胞中，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)与恶性肿瘤的预后相关。一项NSCLC的荟萃分析共纳入了45项研究，11 448例患者，汇总分析表明，TIL密度高表明OS和PFS更长，在亚组分析中发现，肿瘤巢中高密度的CD4+TIL、CD8+TIL提示患者预后较好；若肿瘤基质中Foxp3 TILs为高密度，提示NSCLC患者的复发/无复发生存率较差[21]。这也证实了Treg与其它淋巴细胞在恶性肿瘤免疫中发挥相反作用。对比健康对照者、肝硬化患者，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者外周血凋亡CD8+ T淋巴细胞占总CD8+ T淋巴细胞的比例为25.3%±6.5%，明显高于健康对照组(12.1%±6.5%，t=7.555,P<0.001)和肝硬化组(13.6%±5.8%，t=5.213,P<0.001)，认为肿瘤细胞存在免疫逃逸[22]。提示外周血中的淋巴细胞与肿瘤预后相关。

回顾性分析1681例确诊的HCC患者的外周炎细胞数据、患者和肿瘤特征，在单变量和多变量分析中均发现，中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数是较差OS的独立预后指标，低淋巴细胞计数(<1640×106/L)与 OS 降低显着相关(P<0.05)。且随着巴塞罗那临床肝癌分期的增加，淋巴细胞计数下降(P<0.001)，及外周淋巴细胞(absolute lymphoblastic counter，ALC)计数低与血管侵袭相关[16]。在TME中淋巴细胞发挥重要的抗肿瘤作用，同样外周血中的数目变化也能反应肿瘤细胞对ICI治疗的反应。晚期NSCLC患者≥二线接受单药抗PD-1抑制剂治疗，将基线临界值设为ALC≥2200/μL，发现ALC增加是PFS是一个独立的阳性预后因素，但并未证实基线ALC与OS相关[17]。波士顿医学中心回顾性评估接受nivolumab治疗的22例晚期NSCLC患者，将外周血计数与总生存期和总治疗时间相关联，发现基线ALC和ANC/ALC比率分别与nivolumab上的OS呈正相关和负相关，治疗6周时的ALC和ALC/WBC比值与OS呈正相关，基线及第6周的Kaplan-Meier分析显示，ALC最高的患者组的OS显着增加[23]。淋巴细胞在适应性免疫应答中起核心作用，ICI主要是与肿瘤细胞表面PD-L1受体结合或淋巴细胞表面PD-1受体结合，唤醒“休眠状态”淋巴细胞发挥作用，可将外周血中淋巴细胞数量水平变化最为预测机体对ICI反应的指标，有助于筛选出对ICI敏感的机体。

2.3单核细胞(Monocyte)单核细胞是由骨髓中造血干细胞在粒-巨噬细胞集落刺激因子和巨噬细胞集落刺激因子刺激产生，释放入血液，进入血液的细胞尚未成熟，在血液停留10余小时后迁移至组织发育为巨噬细胞及树突状细胞等，发挥吞噬作用及免疫调节作用，并合成分泌多种细胞因子，包括集落刺激因子、IL、TNF、IFN等。在肿瘤患者中，癌细胞产生的趋化因子(如 CCL2)促进外周血单核细胞向TME中募集，从而促进单核细胞从骨髓募集到外周血,随后进入TME中[24]。肿瘤释放的大量炎症介质，包括细胞因子和趋化因子，影响肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated monocyte, TAM)的功能表型的特征，如IFN-γ，可触发M1极化，M1细胞具有明显的促炎、免疫刺激和抗肿瘤作用，细胞因子如IL-4、IL-13和IL-10促进M2极化，M2细胞参与免疫抑制、促血管生成和促进转移过程，发挥促进肿瘤生长作用，TAM具有较高的可塑性，M1/M2极化态在体内并不稳定，在许多癌症中，不论肿瘤的相对丰度如何，TAM在很大程度上极化为M2表型，表现为TME免疫抑制表型[25]。

将人类外周血单核细胞或人类单核细胞样细胞系 THP-1和 U-937行体外培养，发现来自外周血单核细胞或 THP-1 或 U-937 细胞的条件培养基可刺激卵巢癌细胞的生长，当用抗体中和IL-1、TNF-α、IL-6活性后仍可促进癌细胞生长，说明当单核细胞被吸引到产生巨噬细胞集落刺激因子的卵巢癌时，IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子和其他单核细胞因子由单核细胞旁分泌刺激卵巢癌细胞的生长[26]。取168 名Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者术后标本行免疫组织化学，以评估TAM在癌症微环境中的表达，并在手术前诊断时获取术前血样，发现与低 TAM 组相比，高 TAM组的无进展生存率和总生存率显著较低(分别为P=0.0012 和P=0.0207)，外周单核细胞计数与 TAM 的数量相关(r=0.202，P=0.047)，TAM 的密度创造了有利于癌症发展的微环境，并与不良预后相关[24]。提示外周单核细胞变化可间接反映TAM变化。在HCC中高单核细胞(≥470×106/L)计数与OS降低显着相关(P<0.05)，单核细胞与分期、肿瘤负荷、血管侵犯、肝外转移有关[16]。在ICI治疗中，对转移性NSCLC患者进行了一项小样本量(n=32)的回顾性队列研究，在ICI治疗有应答的患者中，较高的基线AMC与较短的中位缓解时间(P=0.03)相关，且AMC>700/mm3的患者中位缓解时间显着短于AMC≤700/mm3(8周vs12周,P=0.048)[19]。同样，对 157 例接受抗 PD-1 抗体治疗的晚期 NSCLC 患者回顾性登记数据进行了分析，发现接受抗 PD-1 治疗的患者中较高AMC与较差的临床结果相关，高的基线 AMC与死亡风险(HR=1.71)和进展(HR=1.50)显着相关[27]。在肿瘤免疫微环境中TAM主要为免疫抑制作用，TAM能更准确预测ICI治疗疗效，但直接应用TAM为研究对象，需取肿瘤标本，在多数肿瘤患者中取材标本，并不方便，并且也引起患者的恐惧感，外周单核细胞与TAM密度相关，可用外周单核细胞替代TAM预测ICI疗效，多项研究已证明外周单核细胞与ICI治疗效果及预后相关。

2.4嗜酸性粒细胞(Eosinophilic Granulocyte)嗜酸性粒细胞在外周血中仅有少量存在，主要存在与组织中，约为血液中100倍左右，主要参与Ⅰ型超敏反应及对寄生虫免疫。但在炎症诱导的结直肠癌中，发现嗜酸性粒细胞可被招募到肿瘤中，其是独立于CD8+T细胞的肿瘤排斥反应所必需的，在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用，其存活时间可被TME延长[28]。研究发现粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)-转录因子5(interferon regulatory factor5，IRF5)轴是嗜酸性粒细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤活性的关键驱动器，其中IL-10可通过GM-CSF能对抗IRF5激活[29]。生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)是IL-1受体超家族成员，在黑色素瘤中IL-33/ST2轴发挥抗肿瘤作用，IL-33通过激活嗜酸性粒细胞，从而有效杀死目标黑色素瘤细胞[30]。研究发现IL-33介导肿瘤浸润和嗜酸性粒细胞抗肿瘤活性的机制，是通过刺激肿瘤细胞源性趋化因子间接招募嗜酸性粒细胞，而其直接激活嗜酸性粒细胞，上调CD69、黏附分子ICAM-1和CD11b/CD18以及脱颗粒标记物CD63，激活的嗜酸性粒细胞与靶肿瘤细胞建立了大量稳定的细胞结合物，嗜酸性粒细胞效应蛋白(ECP、EPX和颗粒酶-B)和CD11b/CD18极化至免疫突触，导致有效的接触依赖性脱颗粒和肿瘤细胞杀伤，在荷瘤小鼠中，也观察到IL-33诱导肿瘤坏死区域内大量的脱颗粒嗜酸性粒细胞聚集，阻断CD11b/CD18信号显著降低IL-33激活的嗜酸性粒细胞的结合和随后对肿瘤细胞的杀伤[31]。也有研究发现肿瘤相关嗜酸性粒细胞可通过调节免疫细胞组成和/或活性、生长因子和基质金属蛋白酶的分泌以及促进血管生成，在TME中具有间接的促肿瘤活性[32]。

研究发现外周血中嗜酸性粒细胞对ICI治疗具有一定预测价值。一项研究分析32名接受“双免”治疗的黑色素瘤患者循环嗜酸性粒细胞和相关血清炎性因子，发现ICI治疗的临床反应与外周血中嗜酸性粒细胞的积聚有关，ICI治疗可导致嗜酸性粒细胞基因和活化谱的改变、肿瘤组织中嗜酸性粒细胞脱颗粒增强，在治疗期间血清IL-16浓度升高与外周血嗜酸性粒细胞频率增加有关，嗜酸性粒细胞和CD8+T细胞浸润之间呈正相关，认为嗜酸性粒细胞水平可作为黑色素瘤患者的一种新的预测标志物[33]。nivolumab作为二线治疗的晚期 NSCLC 患者中也发现，具有较高的嗜酸性粒细胞计数(>90/L)的患者OS 和 PFS 显着改善[18]。回顾分析了85例nivolumab治疗的铂类难治性复发或转移性头颈鳞状细胞癌(HNSCC)患者，多变量Cox比例风险分析中选择出相对嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞增加率和东部肿瘤协作组工作状态(ECOG PS)作为影响预后评分的变量，使用基于风险比的评分算法进行加权，将患者分为不同组别，发现其与OS相关，证明嗜酸性粒细胞可有效预测接受nivolumab治疗的HNSCC患者的预后[34]。外周血嗜酸性粒细胞绝对计数(absolute eosinophilic granulocyte counter，AEC)不仅可预测经ICI治疗后反应，也可预测免疫相关不良反应发生率，一项研究纳入300例接受ICIs治疗的符合条件的NSCLC患者，ICI肺炎患者的基线AEC水平高于非ICI肺炎患者(P=0.013),AEC高的患者有更高的ORR和更长的PFS[35]。虽大量研究已证实AEC与ICI治疗预后及不良反应相关，但在回顾性分析nivolumab治疗的晚期肾癌患者中，并未发现AEC与OS和PFS相关[36]。因外周血中嗜酸性粒细胞的生理特点易受时间、体内激素影响，昼夜周期波动较大，清晨与午夜数值差异可达40%左右，当血液糖皮质激素浓度较高时，嗜酸性粒细胞数量减低；且嗜酸性粒细胞在TME中具有抗肿瘤及促肿瘤的双重作用。在晚期肾癌患者中未发现AEC与预后相关，不能排除是否受这些因素影响，亦不能排除在晚期肾癌中嗜酸性粒细胞抗肿瘤、促肿瘤作用相当，两者抵消所致。应该增加样本量及规定严格的抽血条件，再次分析。在其它癌种的研究中，发现外周血嗜酸性粒细胞增加在肿瘤ICI治疗中具有阳性预测价值，但需严格掌控抽血条件。

2.5嗜碱性粒细胞(Basophils)成熟的嗜碱性粒细胞数量较少，主要存在于外周血中。当发生炎症时受趋化因子的诱导可进入组织，可被变应原激活脱颗粒释放组胺、白三烯、前列腺素等介质参与Ⅰ型超敏反应。在TME中具有少量的嗜碱性粒细胞(0.4%)[37]。在肿瘤免疫中，活化的嗜碱性粒细胞释放多种促血管生成分子发挥促肿瘤作用，同时也可通过释放颗粒酶B、TNF-α和组胺发挥抗肿瘤作用[38-39]。在小鼠模型中发现，肿瘤内嗜碱性粒细胞通过产生趋化因子CCL3和CCL4增强CD8+T细胞浸润[40]。

但外周血中嗜碱性粒细胞对肿瘤预后的影响尚不清楚。但在具有不同肿瘤组织学和治疗史的卵巢癌患者的血液中发现嗜碱性粒细胞群，认为循环嗜碱性粒细胞数量增多、肿瘤中存在的活化嗜碱性粒细胞均与卵巢癌生存率的提高有关，提示活化的循环和肿瘤浸润性嗜碱性粒细胞可能是潜在的生物标志物[41]。纳入569例I-III期结直肠癌患者，发现术前嗜碱性粒细胞<0.015×106/L是OS、无病生存期(disease free survival, DFS)的独立预后因素[42]。复旦大学癌症中心纳入1029名符合基本标准的I-III期大肠癌患者，发现术前嗜碱性粒细胞计数<0.025×106/L与较高的T分期、较高的N分期、静脉侵犯、神经周围侵犯、血清CEA水平升高以及由此导致的生存率低下密切相关(P<0.05)，术前嗜碱性粒细胞计数低的患者的DFS明显较差[43]。嗜碱性粒细胞对胶质母细胞瘤患者预后也有影响，嗜碱性粒细胞≥0.015×106/L与更好的PFS相关，并为PFS的独立预后因素[44]。虽上诉研究都发现嗜碱性粒细胞计数对恶性肿瘤传统治疗的预后具有阳性预测价值，但并未使用统一的临界值，且因肿瘤相关嗜碱性粒细胞既有抗肿瘤作用，又有促肿瘤作用，该指标是否同样在ICI治疗中适用，目前尚不能得出结论，仍需临床研究加以探索。

2.6血小板(Platelet)血小板是骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落的小块胞质，在生理性止血过程中发挥重要作用。也参与肿瘤微环境的形成，肿瘤细胞释放趋化因子，吸引血小板进入TME中。在TME中，血小板主要发挥两方面作用，一方面通过血小板肿瘤聚集体负责中性粒细胞的募集，另一方面，从血小板递送的细胞因子可对增殖的肿瘤细胞诱导细胞毒性作用，甚至增强细胞凋亡[45]。在结直肠肿瘤细胞中，血小板可渗入肿瘤微环境与肿瘤细胞相互作用，诱导血小板扩散，释放其颗粒内容物，并产生的微粒，微粒在TME中，可释放趋化因子RANTES，MIF，CCL2和CXCL12募集巨噬细胞、及通过IFNγ和IL-4激活其肿瘤细胞杀伤能力，导致肿瘤细胞以p21依赖性方式被细胞周期阻滞；在外周血中，所释放微粒可激活内皮细胞和血小板，并诱导肿瘤细胞从上皮向间充质转化，从而促进转移[46]。体内及小鼠血小板研究中，血小板糖蛋白VI和肿瘤细胞之间的相互作用，通过免疫受体酪氨酸激活基序信号触发血小板活化，导致颗粒释放[47]。在卵巢癌小鼠模型中，发现血小板上的P2Y12[二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)受体之一]、癌细胞与血小板界面的ADP浓度影响小鼠原发性卵巢癌肿瘤的生长[48]。在TME中血小板抑制肿瘤生长，在外周血中则促进肿瘤细胞生长和侵袭。

外周血中血小板数值变化可预测恶性肿瘤预后。NSCLC患者的队列回顾性分析显示，血小板增多症可预测伴有转移性疾病的腺癌患者的低生存率，但在鳞状细胞癌患者中并不明显[49]。在接受ICI联合化疗的晚期肺癌患者中，发现血小板绝对计数与治疗反应相关，但并未发现于OS相关[50]。血小板与其他血指标联合也可发挥预测价值，在恶性黑色素瘤患者中发现ICI治疗的应答者治疗前血小板与淋巴细胞比率低[51]。血小板不仅可用于预测ICI治疗疗效，也可用于预测免疫相关不良反应的发生及超进展。研究发现外周血血小板计数与非小细胞肺癌经ICI治疗后超进展状态显着相关[52]。血小板计数>145 k/μL、以及血小板与淋巴细胞的比率≤534应用ICI的恶性肿瘤患者发生免疫相关不良反应的发生机率较高[53]。外周血小板数值增高提示肿瘤预后差，及经免疫治疗效果欠佳。因在外周血中血小板易受多种因素，波动较大，临床上多于其他指标联合。

3 结语与展望

ICI治疗前外周血中血小板、中性粒细胞、单核细胞计数偏高，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞计数偏低，提示ICI治疗效果不佳；但在不同的研究其临界值不同，尚未发现最佳临界值，仍需大样本量临床研究探索；因单个指标绝对数值的变化，易受检测水平等其它因素影响，若将不同的指标加以组合，可减小偏差，但仍需临床研究探索；每一类血细胞在TME中都扮演着作用相反的双重角色，可以通过促进抗肿瘤、抑制促肿瘤信号机制，研制更多有效的抗肿瘤药物。