MAPK/ERK通路相关蛋白在肺癌组织中的表达及其与肺叶切除术患者预后关系

张 倬，熊 飞，李雪曼

0 引 言

肺癌是指原发于气管、支气管和肺的恶性肿瘤，发病率占所有肿瘤的13%，在我国主要城市中位列恶性肿瘤之首[1]。肺癌临床症状主要表现为咳嗽、咳痰、咳血、呼吸困难等，随病情发展易出现肝转移和骨转移，致死率占所有肿瘤的19.4%，严重危害患者生命安全[2]。对于早期肺癌患者，手术可在一定程度上提高其生存期和生活质量，其中全胸腔镜肺叶切除术因具有出血量少、创伤小等特点被广泛应用于早期肺癌的临床治疗中，但关于其远期随访及预后情况的相关报道依然较少，且缺乏高效的预后评价指标[3]。近年来，随着分子生物学技术水平的不断提高，研究人员在对肺癌的病理机制研究中发现肺癌的遗传学特征和生物学行为是影响其预后的关键环节，其中生长因子信号传导异常在肺癌的发生发展过程中占据重要地位[4]。MAPK/ERK途径是介导肿瘤细胞增殖的主要通路之一，其中细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)是处于MAPK细胞质信号转导通路的终末位置一种蛋白激酶，与其磷酸化产物p-ERK共同参与参与细胞分化、形态维持、凋亡等多种生物学反应，并在细胞恶性转化过程中发挥重要作用[5]。鉴于目前有关MAPK/ERK通路相关蛋白在肺癌组织中的表达及与肺叶切除术患者预后关系分析的研究鲜有报道，本研究通过综合分析肺癌组织ERK1/2、p-ERK1/2表达情况，并评估其与肺叶切除术患者的预后关系，以期为肺癌临床诊疗及预后评估提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源回顾性收集2014年1月至2016年10月于武汉市第三医院胸外科行全胸腔镜肺叶切除术治疗的62例肺癌患者的肺癌组织标本及同一患者距癌变组织>5 cm的癌旁组织标本各62份。肺癌类型：鳞癌25例、腺癌18例、大细胞癌12例、支气管肺泡细胞癌7例。分化程度：低分化16例、中分化35例、高分化11例；临床病理分期：Ia期10例、Ⅱa期18例、Ⅱb期12例、Ⅲa期10例、Ⅲb期6例、Ⅳ期6例。纳入标准：①均符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2018版)》[6]中肺癌相关诊断标准；②均具有全胸腔镜肺叶切除术适应证；③均经病理组织学检查确诊，癌旁组织由病理科主治医师诊断为肺正常组织。排除标准：①肿瘤侵犯胸壁，存在胸腔广泛粘连者；②行全胸腔镜肺叶切除术途中转开胸手术者；③合并其他肺部原发性恶性肿瘤或转移癌者；④术前进行放化疗者；⑤存在严重凝血功能障碍及其他器官功能不全者。本研究通过医院伦理委员会的批准(批准号：AF112)，患者均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂与仪器主要试剂：兔抗人ERK1/2多克隆抗体(1∶10000)、兔抗人p-ERK1/2单克隆抗体(1∶1000)(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗(1∶1000)(美国Proteintech公司)，牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)(上海普迈生物科技有限公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA)抗原修复液(50×)、苏木素染色液、抗体稀释液、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，中性树胶(上海延慕实业有限公司)。主要仪器：S-750T光学显微镜(德国LIOO公司)。

1.2方法

1.2.1 免疫组化染色肺癌组织标本与正常癌旁组织标本取材后用10%中性甲醛固定液固定6 h，常规石蜡包埋，连续切片(切片厚度5 μm)，90 ℃烘片2 h后，二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇脱水，用EDTA抗原修复液进行抗原修复，3% H2O2室温孵育10 min(消除内源性过氧化物酶活性)，PBS洗涤3次，BSA(30 g/L)封闭，37 ℃孵育0.5 h，吸去组织切片周围多余液体，分别加入兔抗人ERK1/2多克隆抗体(1∶10000)、兔抗人p-ERK1/2单克隆抗体(1∶1000)，于4 ℃冰箱中静置过夜，PBS冲洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗(1∶1000)，37 ℃孵育0.5 h，PBS冲洗后使用DAB显色，在光学显微镜下观察，阳性显色为棕黄色颗粒，PBS冲洗终止显色，苏木素复染1 min，1%盐酸-乙醇分化，PBS冲洗后使用梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下进行观察。

1.2.2染色结果判断在每张切片中随机选取5个高倍视野(视野内肿瘤细胞≥200个)，参考Fromowitz等应用的计分法[7]评估染色结果。染色强度评分标准：0分代表无染色，1分代表淡黄色，2分代表棕黄色，3分代表褐色；阳性细胞比例评分标准：0分代表无阳性细胞，1分代表阳性细胞比例<1/4，2分代表阳性细胞比例1/4～1/2，3分代表阳性细胞比例1/2～3/4，4分代表阳性细胞率>3/4。以染色强度和阳性细胞比例得分综合相加计分：得分0分为阴性(-)，得分1～2分为弱阳性(+)，得分3～4分为中度阳性(2+)，得分5～6分为强阳性(3+)。

1.2.3术后随访术后通过电话或门诊方式随访，随访至2021年10月，随访3～60个月，中位时间49个月，平均随访时间(30.25±12.58)个月，共57例患者获得随访。

1.3统计学分析采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计数资料用率(%)描述，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，通过Log-rank检验比较生存率，并拟合Cox回归分析模型评估肺癌组织p-ERK1/2、ERK1/2表达与患者预后的关系。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺癌组织及癌旁组织ERK1/2、p-ERK1/2表达情况ERK1/2、p-ERK1/2阳性表达产物在肺癌组织中主要定位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆中，阳性肿瘤细胞弥漫分布；ERK1/2在癌旁正常组织中表达较少，p-ERK1/2在癌旁正常组织中呈阴性表达。见图1。

a、b：分别为肺癌、癌旁组织ERK1/2表达；c、d：分别为肺癌、癌旁组织中p-ERK1/2表达

2.2肺癌组织及癌旁组织ERK1/2、p-ERK1/2表达比较肺癌组织中ERK1/2、p-ERK1/2表达阳性率均高于癌旁组织(P<0.05)。见表1。

表 1 ERK1/2、p-ERK1/2在肺癌组织和正常癌旁组织中的表达比较

2.3ERK1/2、p-ERK1/2表达与患者临床病理特征的关系ERK1/2、p-ERK1/2在不同性别、年龄、肺癌类型、肿瘤直径患者中表达阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；ERK1/2在不同分化程度、淋巴结有无转移患者中表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；p-ERK1/2在不同分化程度、临床病理分期、淋巴结有无转移患者中表达阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4肺癌组织ERK1/2、p-ERK1/2表达与患者预后的关系Kaplan-Meier生存曲线及log-rank分析显示，ERK1/2、p-ERK1/2表达阳性患者与其表达阴性患者术后累积生存率比较，差异有统计学意义(P=0.021、0.018)。见图2。

a：ERK1/2表达阳性、阴性患者生存曲线；b：p-ERK1/2表达阳性、阴性患者生存曲线

2.5影响肺癌患者预后的危险因素分析单因素分析显示，肿瘤分化程度、临床病理分期、淋巴结有无转移、ERK1/2表达、p-ERK1/2表达均与肺癌患者预后相关，差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox比例风险模型显示，肿瘤分化程度低、淋巴结转移、p-ERK1/2表达阳性均可作为肺癌患者预后评判的风险因素(P<0.05)。见表3。

表 2 ERK1/2、p-ERK1/2表达与患者临床病理特征的关系

表 3 肺癌患者总生存率影响因素Cox回归分析

3 讨 论

肺癌作为常见的恶性肿瘤之一，全球发病率和死亡率呈逐年上升趋势，尽管早期检测和标准治疗取得了不错的进展，但多数患者仍预后不良，5年生存率仅为17%左右[8]。因此揭示肺癌的分子机制和探索新的、有价值的生物标志物对于肺癌的诊疗及预后评估具有重要意义。肺癌的发生和发展是一个多步骤、多基因参与的复杂过程，目前已知细胞信号传导通路的异常激活在肿瘤进展的每个阶段发挥重要作用[9]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸双重磷酸化蛋白激酶家族，其信号系统存在于所有真核生物中，参与细胞增殖、分化、凋亡、癌变等生物学行为过程[10]。MAPK在正常情况下处于静止状态，当细胞受到刺激后会被激活，并表现为逐级磷酸化，进而激活其他蛋白激酶，调控自身信号传导通路，调节基因表达，在肝癌、前列腺癌等多种肿瘤中均可见其异常激活[11]。ERK是最主要的MAPK，是MAPK/ERK通路中的一个关键调节成分，主要包括ERK1～ERK5共5个亚型，其中ERK1和ERK2是目前研究最为深入的2个亚型，具有高度同源性，能催化激活生长因子、细胞因子、肿瘤启动因子等多种细胞因子的磷酸化，进而将各种胞外信号逐级传递至细胞核，调节基因的表达，参与介导细胞周期、增殖、分化、凋亡、侵袭等多种生理过程[12-13]。经典的MAPK通路是由ERK1/2信号传导蛋白介导的，其功能是传递丝裂原信号，ERK1/2磷酸化后即为p-ERK1/2，p-ERK1/2是ERK1/2的活化形式，磷酸化后的ERK1/2(p-ERK1/2)将从细胞胞浆进入胞核，作用于细胞核内的c-jun、NF-κB、c-fos等转录因子，通过磷酸化其他蛋白底物(如细胞骨架相关蛋白、转录因子、酶类等)调节相应基因表达，进而参与细胞生长、发育等，并在细胞恶性转化等病理过程中起重要作用，相关研究表明ERK1/2在肺癌中多表现为异常活化，ERK异常活化后，细胞分化、凋亡功能丧失，发生恶变而形成肿瘤，并且其侵袭、转移能力也得到增强[14]。

本研究通过免疫组化分析，阐明了MAPK/ERK通路相关蛋白ERK1/2和p-ERK1/2在肺癌组织和癌旁组织中的表达情况，揭示了ERK1/2和p-ERK1/2与肺癌分化程度、临床病理分期、有无淋巴转移和预后的相关性。与癌旁组织相比，ERK1/2和p-ERK1/2在肺癌组织中的表达阳性率明显升高，ERK1/2表达与肿瘤细胞分化程度、淋巴转移有关，而p-ERK1/2表达与肿瘤细胞分化程度、临床病理分期、淋巴转移密切相关，说明低分化、淋巴转移肺癌患者肿瘤细胞ERK1/2和p-ERK1/2表达阳性率明显升高。Chen等[15]研究显示，相较于正常细胞，肺癌细胞中p-ERK1/2表达升高，促进细胞增殖和侵袭。ERK1/2信号通路在肺癌患者中被明显激活，呈现高表达，其磷酸化水平显著增加，提示肿瘤细胞的生物学性质较为活跃，表现为肿瘤细胞增殖加快，容易发生侵袭和转移，而一旦抑制ERK1/2的磷酸化(p-ERK1/2)表达即能通过抑制细胞的增殖、诱导凋亡发挥抑制肺癌的作用[16-17]。此外我们通过调查随访发现，ERK1/2、p-ERK1/2表达阳性患者与其表达阴性患者术后累积生存率存在一定差异，单因素分析显示，肿瘤分化程度、临床病理分期、淋巴结有无转移、ERK1/2表达、p-ERK1/2表达均与肺癌患者预后相关，多因素Cox比例风险模型显示，肿瘤分化程度低、淋巴结转移、p-ERK1/2表达阳性均是影响肺癌患者预后的危险因素，提示ERK1/2磷酸化形式在肺癌预后判断方面更具有实际应用价值，可作为评判肺癌患者预后的重要指标。

综上所述，MAPK/ERK通路相关蛋白ERK1/2、p-ERK1/2在肺癌组织中呈现高表达，与肿瘤细胞分化程度、临床病理分期、淋巴转移密切相关，其中p-ERK1/2表达阳性是肺癌患者预后的风险因素。