MNP-PEG-Gd纳米粒子在脑胶质母细胞瘤磁共振成像和光热治疗的实验研究

刘晓佳，石 莹，王鹏丽，刘鹏飞

0 引 言

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人中枢神经系统最常见的颅内原发恶性肿瘤，世界卫生组织将其划分为Ⅳ级，五年生存率为7.2%[1-3]。GBM的主要治疗手段是手术切除肿瘤组织及联合放化疗。临床上磁共振成像是目前术前诊断GBM的重要检查技术，但由于GBM呈浸润性生长，与周围脑实质分界不清楚，肿瘤边缘不易确定，致使手术难以完全切除肿瘤组织，且多次放化疗后肿瘤易产生放化疗抵抗，故GBM易复发、预后差[4-6]。引入对比剂确定肿瘤边界以提高手术切除精度以及开发特异性辅助治疗方式已成为目前研究的重点。本研究的目的是通过采用内源性生物材料黑色素制备得到黑色素纳米粒子，再由聚乙二醇修饰后和金属离子Gd3+螯合，构建MNP-PEG-Gd纳米粒子，验证其生物相容性和安全性，探究该纳米粒子的体内磁共振成像和光热治疗GBM的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与设备黑色素购自Sigma-Aldrich，六水氯化钆(Ⅲ)(GdCl3·6H2O)、NH2-PEG5000-NH2、磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline, PBS)购自阿拉丁试剂(上海)，人脑胶质瘤U251细胞系最初由美国型培养菌种集(ATCC, Manassas,VA)提供，实验动物为雌性 Blab/c 裸鼠购自维通利华；真空冷冻干燥机购自北京博医康实验仪器有限公司，透射电子显微镜(TEM)购自日立公司，马尔文粒度分析仪购自美国Brookhaven公司，电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)，Thermo Scientific 3.0T磁共振临床扫描仪购自飞利浦公司，近红外激光发射器购自长春新产业光电技术有限公司。

1.2MNP-PEG-Gd纳米粒子的制备MNP-PEG-Gd纳米粒子的制备方法参照文献[7]，并在此基础上稍调整。将20 mg黑色素溶于0.1 mol/L NaOH水溶液中，在约60%的高振幅超声振荡下滴加0.1 mol/L HCl水溶液将pH调至中性，超声声震仪处理2 min。过滤、离心、洗涤，冻干得到粉末状MNP。将1 mg/mL MNP溶液用NaOH溶液调至pH为9.5，再将其滴加到pH为9.5的NH2-PEG5000-NH2水溶液中，磁力搅拌1 2h，超声声震仪处理2 min，离心、洗涤、冻干得到MNP-PEG固体粉末。将1 mL的GdCl3溶液(5 mg/mL)加入到1mL的MNP-PEG(2 mg/mL)溶液中，室温下搅拌反应4h，超声声震仪处理2 min，离心、洗涤、冻干得到MNP-PEG-Gd固体用于后续体内外实验研究。

1.3MNP-PEG-Gd纳米粒子的表征透射电子显微镜观察其形态；动态光散射检测其粒径大小及电势；傅里叶变换-红外(FT-IR)光谱仪检测化学键连接情况；5次近红外激光(808 nm，2 w/cm2，5 min)照射加热循环后，紫外-可见-近红外光谱仪检测其吸收光谱以考察其光稳定性；通过透析实验来评估其金属螯合稳定性。将MNP-PEG-Gd放入透析袋(MWCO 3500D)中，室温下置于10mLPBS中磁力搅拌透析48 h，在一定时间点取出透析液，用新鲜PBS代替，电感耦合等离子体质谱仪分析来测定透析液中金属离子的含量。

1.4体外磁共振成像和光热效应将1 mL不同金属离子浓度(0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L)的MNP-PEG-Gd和马根维显水溶液置于试管中，室温下行3.0T磁共振扫描，r1值由1/T1(S-1)对金属离子浓度(mmol/L)的曲线拟合结果的斜率计算得出。扫描参数如下：FOV，130×130 mm2;层厚,1 mm；矩阵,152×126；层间距，0；TE,10 ms；TR,400、600、800、1000 ms。用近红外激光(808 nm，2 w/cm2)对1mL不同浓度(125、250、500、1000 μg/mL)的MNP-PEG-Gd水溶液和相同体积PBS进行5 min的照射，同时将1000 μg/mL的MNP-PEG-Gd水溶液以不同功率密度(1.0、1.5、2.0 w/cm2)照射5 min，用热成像仪每隔30 s记录一下溶液的温度并做温度曲线分析其光热转换能力。

1.5细胞与肿瘤模型将U251细胞移至含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的改良DMEM中，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。每天监测细胞形态，每隔48h更换一次培养液，用于后续细胞和动物实验。皮下注射含5×106个细胞的0.1 mLPBS于BALB/c裸鼠的左背部区域，置于无菌环境下饲养，使用游标卡尺定期测量肿瘤大小，同时每天观察动物是否有任何行为异常，每周称重。

1.6体外细胞毒性试验和细胞光热实验U251细胞以8000个/孔的密度接种于96孔板中，孵育24 h后，用PBS洗涤后加入含MNP和MNP-PEG-Gd(0、125、250、500和1000 μg/mL)的培养基继续培养24 h，弃培养基，PBS洗涤，向各孔中加入含20 μL MTT溶液(5 mg/mL)的新鲜培养基孵育4 h，弃去MTT溶液加入100 μL DMSO，使用490 nm波长测量各孔吸光度值，计算细胞存活率。进一步评价MNP-PEG-Gd的细胞光热作用，先将细胞以8000个/孔的密度接种于96孔板中孵育24 h，再将MNP-PEG-Gd(0、125、250、500和1000 μg/mL)与细胞共孵育后，用近红外激光(808 nm，2 w/cm2)照射5 min，MTT法检测细胞毒性。

1.7体内磁共振成像和光热治疗腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉荷瘤裸鼠，室温下行3.0T磁共振扫描获得注射前后荷瘤裸鼠轴位和冠状位磁共振图像。裸鼠(n=6)通过尾静脉注射样品(20 mg/mL，50 μL)，在不同时间点(0.5、1、2、4、6、8、24、48、72、96、120 h)获得轴位和冠状位磁共振图像，扫描参数如下：(轴位)FOV，45×45 mm2;层厚,1 mm；矩阵,152×126；层间距，0；TE,10 ms；TR,674 ms；NSA,3。(冠状位)FOV，45×70 mm2;层厚,1 mm；矩阵,152×198；层间距，0；TE,10 ms；TR,674 ms；NSA,3。通过MR信号增强(signal enhancement,SE)评估体内MRI成像效果，其计算公式如下：

SE=(SIpost-SIpre)/SIpre×100%

SIpost和SIpre分别表示注射MNP-PEG-Gd前后组织中的信号强度。

光热治疗时将裸鼠随机分为两组:对照组和MNP-PEG-Gd+激光组。MNP-PEG-Gd+激光组瘤内注射样品MNP-PEG-Gd(1 mg/mL，50 μL)，对照组注射相同体积的PBS，两组均用近红外激光(808 nm，2 w/cm2)照射裸鼠5 min。用热成像仪每隔30 s记录一下肿瘤区域温度。不同治疗后每隔一天检查记录肿瘤大小和体重。肿瘤体积按公式计算：

肿瘤体积=肿瘤长度×(肿瘤宽度)2/2

2 结 果

2.1 MNP-PEG-Gd纳米粒子的理化性质MNP-PEG-Gd纳米粒子呈均匀球形，分散性好，流体动力学直径为24 nm左右，表面电荷为(-4.77±1.05)mV。5次加热循环后仍具有与MNP相似且良好的光吸收度，表明其具有较好的光稳定性。仅在前2 h内有1%的金属离子游离出来，表现出较高的金属离子螯合稳定性。见图1、图2。

图 1 MNP-PEG-Gd电镜图

a:MNP-PEG-Gd的流体动力学尺寸; b:MNP-PEG-Gd的红外光谱; c:MNP、MNP-PEG和MNP-PEG-Gd的紫外吸收光谱; d:MNP-PEG-Gd的螯合稳定性

2.2体外磁共振研究结果表明，随着Gd3+离子浓度的增高，磁共振T1加权成像越来越亮，并与相同浓度的马根维显相比有更好的磁共振成像效果。拟合曲线得到MNP-PEG-Gd的r1值为46.40 mM-1s-1，高于临床批准使用的马根维显的r1值(4.046 mM-1s-1)，有较高的弛豫率。见图3。

2.3体外光热效应MNP-PEG-Gd的光热转换能力随时间的增加而增强。照射5min后125、250、500、1000 μg/mL的MNP-PEG-Gd水溶液温度最高升至40.1、42.2、49.0和55.0 ℃，而PBS的温度仅升至30.1 ℃，有良好的光热转换能力。此外，其光热转换能力还随着照射功率密度的增加，温度也随之增加。见图4。

a:各浓度梯度下MNP-PEG-Gd和马根维显的磁共振T1加权图像；b:MNP-PEG-Gd和马根维显的弛豫率

a:PBS和各浓度MNP-PEG-Gd的时间温度曲线；b:同一浓度MNP-PEG-Gd随不同照射功率密度的时间温度曲线

2.4体外细胞毒性测定和细胞光热治疗效果与MNP-PEG-Gd共孵育的各组细胞存活率并无显著差异(P>0.05)，且均在89%以上。而当有激光照射时，细胞的存活率随MNP-PEG-Gd的浓度增加而下降；当MNP-PEG-Gd浓度为250 μg/mL时细胞存活率低于89%；当MNP-PEG-Gd浓度为1000 μg/mL时细胞存活率仅是30%左右；当MNP-PEG-Gd浓度达到500 μg/mL以上时，MNP-PEG-Gd+Laser和MNP-PEG-Gd细胞存活率具有统计学差异(P<0.05)。根据以上结果，选择1000 μg/mL为后续实验所需浓度。见表1。

表 1 不同实验条件及不同浓度细胞存活率比较

2.5体内磁共振成像研究注射样品0.5 h后，肿瘤区域信号明显增强，SE值约为18%，而肌肉信号微增高，SE值约为9%。6h信号增强到最大，肿瘤SE值增加至34%，肌肉SE值增至21%。24 h后信号明显降低，肿瘤SE值降低至16%，肌肉SE值低至4%。72 h肿瘤和肌肉信号强度分别下降至与注射样品前相似，有良好的磁共振成像能力和组织对比度。注射MNP-PEG-Gd后1 h肝SE值增强幅度最大约为43%，2 h肾SE值达到最大增强幅度约为36%，24 h后开始明显降低，120 h几乎为0，其可通过肝、胆、肾途经排泄。见图5-图7。

2.6体内光热治疗疗效MNP-PEG-Gd+激光组肿瘤区域温度大幅度上升，最终达到52.9 ℃，可有效消融肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。而对照组肿瘤区域温度仅升高至41.1 ℃，未达到光热治疗所需的温度值对肿瘤几乎没有抑制作用，肿瘤体积持续增加。在整个实验过程中，两组裸鼠体重均未发现异常，体内安全性较好。见图8。

a-e:分别为0、0.5、6、24、72 h

a-i:分别为0、0.5、1、2、24、48、72、96、120 h

图 7 肝和肾的SE定量分析图

a:荷瘤裸鼠肿瘤区域的时间温度曲线；b:肿瘤生长曲线；c:体重曲线

3 讨 论

本研究利用黑色素制备出水溶性的黑色素纳米粒子，再通过聚乙二醇对其进行表面修饰，最后Gd3+螯合，成功构建出MNP-PEG-Gd纳米粒子。MNP-PEG-Gd纳米粒子表面电荷为-4.77 mV，表明其体内稳定性好。在1110 nm和2880 nm左右处有特征吸收峰存在表明MNP成功连接上PEG，Ju和Xu等[8-10]研究表明不含Fe3+或Gd3+的MNP和MNP-PEG在T1或T2上均未显示任何的信号增强，螯合金属离子后磁共振信号明显增强，故体外磁共振成像显示的高信号辅助验证了MNP-PEG-Gd的成功合成。电感耦合等离子体质谱仪检测该纳米粒子仅前2h内有1%左右的金属离子游离出来，这部分离子可能是纳米粒子通过弱静电相互作用吸附的金属离子[11]。经过5次近红外激光照射加热循环后，紫外-可见-近红外光谱无明显变化，仍保持较好的吸收度，表明其有良好的光热稳定性。体外磁共振成像研究表明其有较高的r1弛豫率，且随着MNP-PEG-Gd纳米粒子中Gd3+浓度增加，磁共振T1加权图像上信号也越来越亮，与之前研究结果一致[12]。由于其较高的r1弛豫率，与常规对比剂相比可减少对比剂使用剂量，进一步降低了钆沉积和肾源性系统性纤维化的风险[13]。体外光热效应结果显示MNP-PEG-Gd有良好的光热转换能力，且光热转换能力与浓度强烈相关，随浓度增加而增加，最高可达55℃，而且还对激光照射能量有依赖性。

鉴于MNP-PEG-Gd纳米粒子良好的特性，我们又进行了细胞和动物水平的研究。细胞毒性试验显示，当MNP-PEG-Gd纳米粒子浓度为1000 μg/mL时仍无显著细胞毒性，与Meng等[14]研究结果相似。细胞光热治疗结果显示，在激光照射下，细胞存活率随MNP-PEG-Gd纳米粒子浓度增加而降低，具有其有良好的细胞光热治疗效果。经尾静脉向荷瘤裸鼠注射MNP-PEG-Gd纳米粒子后0.5 h可见肿瘤区域信号增强，实现了MNP-PEG-Gd纳米粒子对脑胶质母细胞瘤的体内磁共振成像。随着时间的推移，肝、肾信号也分别在1 h和2 h处显著增强，又在24 h后显著降低，120 h后恢复至注射前水平，证明其可以通过肝肾系统清除，进一步降低了生物毒性，生物安全性良好，与体外细胞毒性试验结果相一致。经瘤内注射向荷瘤裸鼠注射MNP-PEG-Gd纳米粒子进行体内光热治疗，肿瘤区域温度最高可升至52.9 ℃。据报道，当温度升高到40～44 ℃就足以对肿瘤生长产生负面影响，中度热疗(45 ℃)可诱导人GBM细胞系和鼠胶质瘤动物模型细胞发生温度依赖性凋亡[15]。MNP-PEG-Gd+激光组温度达45 ℃以上持续3 min左右，可有效消融肿瘤细胞，抑制肿瘤生长，显示良好的肿瘤光热治疗作用。

目前已有一些纳米材料用于光热治疗研究，主要可分成无机材料和有机材料两类[16]。无机材料主要包括金属类，有机材料主要包括可吸收NIR的小分子物质和半导体聚合纳米粒子。研究较多的金属类包括金、银、铂、钯、铁和铜等。金纳米粒子于2003年首次被用于光热治疗，由于该纳米粒子具有较高的光热转换效率且易于合成和修饰等特点，目前研究最为广泛[17]。但材料制备成本较高、生物相容性较差和远期体内安全性未知的缺点限制了其临床转化。其他用于MRI引导下的光热治疗的纳米材料，如掺铁硫化铜纳米粒子、二硒化铁纳米粒子和Au-FePt杂化各向异性纳米结构等，尽管在肿瘤治疗方面很有潜力，但较差的生物降解性和长期的潜在毒性严重影响了其临床应用[18-20]。有机材料包括一些小分子物质(菁染料、卟啉和酞菁等)和半导体聚合物纳米粒子[21]。菁染料具有易修饰，吸收峰可调整等特点，其中的吲哚菁绿已经被美国食品与药品监督管理局批准用于临床。Pan等[22]通过自组装方法制备的吲哚菁绿纳米胶束不仅具有较高的载药量，并且体内循环时间较长，增加了在肿瘤部位的聚集。虽然吲哚菁绿有众多优势，但其光稳定性仍有待提高，而且其在生理介质中易被降解。聚吡咯因其突出的光稳定性、传导性和生物相容性而受到外均表现出良好的光热效应[23]。本研究采用的MNP富含吡咯环和苯环，具有良好的光热转换能力，且MNP作为一种内源性物质，与外源性材料相比具有更好的生物相容性和安全性，易于代谢，避免了体内蓄积，此外MNP-PEG-Gd纳米粒子还具有良好的MRI增强能力，为实现GBM诊疗一体化提供了新的思路。

此外本实验也具有一定的局限性，未建立原位肿瘤模型进行磁共振成像和光热治疗的研究。此外，体内安全性只通过注射样品后裸鼠体重来侧面表征，未进行重要器官H&E染色来验证其体内安全性。后续有待继续研究。

综上所述，本研究成功构建了MNP-PEG-Gd纳米粒子，不仅具有良好的生物安全性和生物可降解性还具有良好的GBM磁共振成像性能和光热治疗效果，为GBM诊疗一体化提供一种新思路。