Nrf2抑制缺血性脑卒中后铁死亡的研究进展

冯一璇，苏凯奇，丁志敏综述，冯晓东审校

0 引 言

缺血性卒中是由脑局部血液供应不足引起的一种常见脑血管疾病，越来越多的年轻人患有这种疾病，严重危害人类健康，其发病率约占脑卒中的70%[1]。缺血性脑卒中造成神经元损伤的原因复杂多样，有氧化应激、能量衰竭、兴奋性中毒及神经炎症等，其中氧化应激及其反应产物通过破坏构成神经细胞的DNA、蛋白质和脂质来引发细胞死亡。因此，减少氧化应激引起的神经损伤是防治缺血性脑卒中的重要方法。

铁死亡是一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性细胞死亡[2]。研究发现，氧化应激是铁死亡发生的重要原因[3]，抑制铁死亡能够减轻脑卒中后的神经损伤[4]，但铁死亡影响脑卒中的深层分子机制尚不清楚。已有证据表明，作为机体抗氧化反应的主调节因子，核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)参与铁死亡级联反应的调控[5]。上述研究提示，Nrf2可能通过调控铁死亡发挥抗氧化作用来减轻缺血性脑卒中后的神经损伤。本文以氧化应激为纽带，通过综述Nrf2、缺血性脑卒中与铁死亡三者之间的联系，深入探讨铁死亡对缺血性脑卒中的影响机制，阐述Nrf2对缺血性脑卒中的神经保护作用，指导缺血性脑卒中的治疗。

1 铁死亡与缺血性脑卒中

1.1 铁死亡的定义与特点铁死亡，是一种铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡方式。其发生机制为细胞膜上过度表达的不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)在二价铁或脂氧合酶的催化下发生脂质过氧化，从而引发细胞死亡。铁死亡这种新型细胞死亡方式，其生化、基因和形态上均存在独特性。从生化方面来看，谷胱甘肽(glutathione,GSH)被耗尽，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4 ,GPX4)活性下降不能代谢脂质过氧化物，从而导致游离的Fe2+通过芬顿反应(Fenton)氧化脂质造成活性氧堆积引发铁死亡[6]。从基因角度来看，铁死亡的具体调控机制尚不明确，但有研究证明其被调控的过程主要涉及铁代谢的异常、脂质过氧化物的积累、GPX4 的失活等[7]。从形态层面来看，主要表现为线粒体萎缩变小、嵴减少甚至消失、膜密度增高[6]。

1.2铁死亡中的氧化应激现象氧化应激是人体抗氧化系统不足以清除过多的自由基时产生的细胞损伤现象。过剩的活性氧(reactive oxygen species,ROS)化学性质极度活跃，可破坏细胞DNA、蛋白质和脂质分子，从而造成组织损害并引发多种疾病。现有研究充分证明，氧化应激不仅与很多疾病的发生有密切关系，还参与铁死亡等多种类型的细胞死亡过程[8]。其中，铁死亡发生过程中的关键角色，如胱氨酸/谷氨酸反向转运体(System XC-)、铁离子等可通过促进ROS的产生来影响铁死亡[3]。

已知System XC-是细胞摄取谷氨酸生成GSH以对抗脂质过氧化物的积累并抑制铁死亡的重要抗氧化途径。最早在谷氨酸引发的细胞死亡中发现了ROS造成的氧化损伤，而谷氨酸引发的细胞损伤可通过抑制System XC-产生[9]。这提示ROS可能是抑制System XC-从而造成GSH水平下降的重要原因。Dixon等[10]通过实验发现铁抑制剂erastin还可抑制System XC-的功能，说明铁死亡过程中也存在着GSH水平的下降。众所周知，铁参与的电子转移是机体进行有氧代谢生成活性氧的重要环节，其中Fe2+可以诱导氧化应激反应。而铁离子对铁死亡的重要性在于：铁死亡依靠铁离子参与构成脂氧合酶与催化细胞内的氧化还原反应等；细胞对铁离子的摄入、储存、利用和排出影响着铁死亡的敏感度。因此，铁离子可能是氧化应激与铁死亡建立联系的桥梁。Luo等[11]在进行改进青蒿素抑制癌细胞的实验时观察到，添加有转铁蛋白肽的智能纳米药物能升高胞内Fe2+的水平，增加活性氧、减少GSH，导致氧化应激并杀死癌细胞。Totsuka等[12]发现，氧化应激通过反馈性影响铁稳态调节相关基因的表达调控胞内Fe2+的浓度。氧化应激与铁死亡之间的相关性让我们看到了解释疾病发生机制的新方向，也为更多疾病的治疗开辟新途径。

1.3缺血性脑卒中的铁死亡发生机制缺血性脑卒中可导致神经元死亡和功能障碍，目前，恢复脑血管血流再通是临床上治疗这一疾病的主要方式。但脑组织血流再通往往会通过诱发氧化应激、炎症反应等损伤神经细胞。因此，研究者迫切寻求着治疗该病更加有效的方法。自2012年铁死亡被定义至今，越来越多的研究将铁死亡作为探讨不同疾病的发病机制的切入点，以期为疾病的预防和治疗寻找新的思路，与缺血性脑卒中相关的研究也不例外。有研究发现，铁死亡发生的两个核心事件即神经细胞内游离铁的增加和脂质过氧化物的积累，与脑缺血再灌注引起的氧化应激有着密切联系[13-14]，这就为铁死亡与缺血性脑卒中的关联建立了可能性。因此，我们将从神经细胞的铁超载与脂质过氧化两个方面来阐述铁死亡与缺血性脑卒中之间的关系。

1.3.1神经细胞的铁超载铁超载是神经细胞发生铁死亡的关键因素之一。正常情况下，神经细胞内的铁稳态依赖细胞铁摄入与排出之间的动态平衡。转铁蛋白(transferrin,Tf)作为胞外游离铁的搬运者，收集胞外游离的Fe3+后与细胞膜上的转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)结合。TfR用细胞膜将Fe3+与Tf包裹成内涵体送进胞内，由此打开Fe3+进入细胞的大门。随后，前列腺6次跨膜上皮抗原3(six transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3)在内涵体内将Fe3+转化为Fe2+。最后，Fe2+被二价金属转运体(divalent metal transporter 1,DMT1)转移至细胞胞质内。胞质内游离的Fe2+可作为胞内细胞器的生理代谢原料被消耗；可由膜铁转运蛋白(ferroportin,FPN)介导排到胞外；可参与Fenton反应生成ROS从而对神经细胞造成氧化损伤；也可与铁蛋白结合储存在胞内。有研究发现，缺血性脑卒中患者大脑中的铁、Tf和 TfR 水平均出现了不同程度的升高[15-16]，说明神经细胞上调了Tf和TfR的表达从而增加了对铁的摄入。还有研究发现，脑缺血再灌注后帮助FPN发挥正常铁排出功能的tau蛋白表达被抑制，导致细胞内的游离铁排出受阻[17]。这提示着神经细胞内的铁稳态被打破，胞内铁超载形成。胞内大量找不到出口的游离铁不仅增强Fenton反应进而产生大量的ROS来损伤细胞膜直接引发铁死亡，还参与催化脂质过氧化物的脂氧合酶的合成间接导致铁死亡。

1.3.2神经细胞的脂质过氧化引发铁死亡的另一关键过程是神经细胞的脂质过氧化。正常情况下，细胞膜上的PUFAs如花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或肾上腺酸(adrenoic acid,AdAA)与乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)先后反应，后分别经长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4)和溶血卵磷脂酰基转移酶3(lysophosp-hatidylcholine acyltransferase 3, LPCAT3)的催化生成AA/AdA-PE。但缺血性脑卒中发生后，胞内超载的铁离子参与合成的脂氧合酶会将AA/AdA-PE氧化为脂质过氧化物，如不及时清除大量堆积会干扰和破坏膜的生物功能进而引发铁死亡。神经细胞的铁超载与脂质过氧化物的形成是引发铁死亡的基础，而System XC-与GPX4的抗脂质过氧化的能力不足则会加速铁死亡发生。System XC-是一种受胞内高浓度谷氨酸调控的反向转运体，不需要消耗ATP便能等量转入胱氨酸转出谷氨酸。这是细胞摄取谷氨酸合成GSH的重要途径，而GSH的合成多少又影响着关键抗氧化酶GPX4 的活性。GPX4通过还原脂质过氧化物为脂质醇来抵抗细胞发生铁死亡。由此可见，System XC-与GPX4是重要的抗氧化系统，通过对抗脂质过氧化物的积累来抑制铁死亡。

2 Nrf2与缺血性脑卒中

2.1 Nrf2的结构和功能Nrf2归于CNC-bZIP转录因子家族，其分子量为 66000，是机体抗氧化的重要角色。正常情况下，在细胞质中Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)负调控Nrf2使其发生泛素化后被蛋白酶体快速降解[18]，故Nrf2在胞质内的表达水平较低。氧化应激等反应发生时，Nrf2与Keap1解离并活化，转入细胞核形成具有共激活因子的复合物与启动子区域的抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合，上调ARE基因，诱导解毒基因的转录，增强机体抗氧化应激的能力，从而减轻氧化应激对机体的损伤，达到保护机体的最终目的[19]。

2.2Nrf2在缺血性卒中期间的作用机制受缺血性脑卒中后氧化应激的刺激，Nrf2脱离Keap1的调控，转移至细胞核与ARE结合，激活下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的靶基因表达，发挥抗氧化作用，减轻缺血脑组织的损伤。这些酶主要是：过氧化氢酶(catalase,CAT)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及醌氧化还原酶1(nicotinamide quinone oxidoreductase 1,NQO1)等。宋秋英等[20]研究银杏叶提取物联合麦角林治疗急性缺血性脑卒中的疗效时发现，联合用药的优势与银杏提取物改善异常蛋白在Keap1-Nrf2/ARE信号通路的表达有关。同样，田琴等[21]对缺血性脑卒中患者进行外周血清检测时观察到，缺血性脑卒中组患者外周血中Keap1的mRNA表达比健康对照组显著降低，而Nrf2、ARE、HO-1、NQO1的mRNA表达明显增高；卒中组患者血清中丙二醇等氧化应激的标志性分子量也显著高于对照组且与Keap1、Nrf2、ARE的mRNA的表达量呈正相关。上述研究提示，Nrf2可能通过抑制脑缺血缺氧后诱导的氧化应激反应减轻神经元损伤。周涛等[22]发现己酮可可碱提高了局灶性缺血再灌注模型大鼠脑部的Nrf2蛋白水平，从动物实验层面证明Nrf2的激活能增加其下游靶基因 SOD、GPX4等的表达，进而减轻ROS造成的神经损伤。另有研究检测神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞时发现了Nrf2与HO-1[23]，说明此类抗氧化分子在大脑皮层广泛存在。目前，Nrf2已被证明是中医药等神经保护药物减轻缺血性脑卒中后氧化应激损伤的重要靶点[20, 22, 24]。

3 Nrf2与铁死亡

3.1 Nrf2抑制铁死亡以往与Nrf2有关的研究更多关注其抗氧化能力，随着人们对铁死亡的发现和深入了解，研究人员开始聚焦Nrf2在不同疾病中抑制铁死亡的情况。Fan等[25]通过癌细胞实验证明，Nrf2表达水平的上调可抑制铁死亡，减少则促进了铁死亡。钟桂玲等[26]在探讨普罗布考治疗大鼠心肌细胞铁死亡的机制时发现，相比对照组，实验组细胞Nrf2、GPX4蛋白的表达水平显著提高，胞内ROS浓度明显降低，细胞活性更强。上述研究不仅证实Nrf2可抑制铁死亡，还提示其抑制铁死亡的能力可能与抗氧化有关。

3.2Nrf2调控铁死亡相关基因的表达

3.2.1 Nrf2抑制神经细胞的铁超载铁蛋白，由其两种亚基即重链(ferritin heavy chain,FTH1)和轻链(ferritin light chain,FTL)构成，作为胞内的储铁蛋白，其核心储备Fe3+的数量最多能达到4500个[27]。研究发现，Nrf2通过与FTH1 和 FTL 基因的上游中的 ARE 序列结合来调控铁蛋白[28]。铁蛋白对于缓解胞内铁超载至关重要：一项脑缺血患者脑部铁沉积现象的MRI研究[29]和随后发现脑部的铁、Tf和 TfR 水平在脑缺血后均出现了不同程度的升高的研究[15, 16]共同说明脑缺血后神经元上调Tf和TfR的表达，增加胞内游离铁含量，铁蛋白代偿性表达增加以减少游离铁，于是脑MRI显示出铁沉积。Liu等[30]在一项实验研究中发现，Nrf2可以通过增加FTH1的表达来扩大铁的存储容量，并促进与GSH合成相关的基因表达来缓解GSH水平的下降，使细胞增强对氧化应激的耐受性，从而抵抗铁死亡。同样，Nrf2通过结合FPN基因启动子序列中包含的ARE实现其调控作用。FPN是胞内唯一的铁输出蛋白，决定脑血脑屏障和脉络丛的铁输出，在神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞均有分布[31]。Harada等[32]的小鼠实验证明，Nrf2 的激活剂diethyl malate和sulforaphane的确能上调FPN的mRNA水平。总之，Nrf2通过调控关键的铁储存、输出和运输蛋白(如SLC40A1和BLVRA/B)的转录来抑制铁死亡，类似研究证实了这一点[33]。

3.2.2Nrf2抑制神经细胞的脂质过氧化Nrf2能够正向调控对抗铁死亡中脂质过氧化的System XC-与GPX4的关键合成酶基因；此外，膜内内源性抗脂质过氧化关键再生基因即铁死亡抑制基因(AIFM2/FSP1)也受Nrf2调控；还有其他下游抗氧化酶基因如HO-1也被Nrf2调控表现为促进编码转录。研究证明，Nrf2促进构成System XC-中的SLC7A11与GPX4的基因转录。在缺血性脑损伤中，外源性褪黑素上调Nrf2-GPX4，减少神经细胞铁死亡，进而改善大鼠学习、记忆和认知能力。近期研究发现，AIFM2被证实可抑制FSP1导致的铁死亡级联反应的强大激活[34]。而Nrf2与AIFM2启动子的结合，说明这种铁蛋白级联的调控因子也是Nrf2的靶基因[35]。Nrf2还调控着重要抗氧化蛋白HO-1[36]。HO-1降解血红素回收铁[37]，其降解产物之一胆绿素，可被胆绿素还原酶(BLVRA和BLVRB)还原为胆红素，Nrf2对其基因行正调控[38]。有研究表明，适当剂量的HO-1可以使胆红素清除氧自由基以抵抗脂质过氧化[39]。然而有趣的是，HO-1表达过量会起到恰好相反的作用，细胞中的氧化还原系统失衡加剧并进一步诱导铁死亡[40]。除上述调节作用，Nrf2还可调控GSH的合成、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen,NADPH)的再生等，这使Nrf2成为抑制铁死亡的重要控制器[15]。其中NADPH是铁死亡的诱导剂FIN56在细胞系中的敏感标志物[41]，可帮助与诱导铁死亡有关的蛋白如GR、TXNRD、FSP1、AKR、ALDH发挥作用[42-45]。这些研究均证实了Nrf2可靶向调控NAPDH的再生以抑制铁死亡。

4 结语与展望

综合以上证据，我们推断Nrf2可抑制缺血性脑卒中后铁死亡。通过系统阐述Nrf2与铁死亡、缺血性脑卒中、氧化应激三者之间的关系，让我们看到了Nrf2调控缺血性脑卒中后铁死亡的可能性。Nrf2靶向调节缺血性脑卒中后铁死亡相关基因的过程与其发挥抗氧化作用的过程相似，均上调了其下游抗氧化酶的表达。这提示着Nrf2抑制缺血性脑卒中后的铁死亡可能是其抗氧化的结果。前人对缺血性脑卒中的铁死亡和Nrf2进行了细胞、动物实验等不同层面的探讨，但关于Nrf2在缺血性脑卒中后铁死亡中的具体作用机制却鲜有报道。本文综述了Nrf2抑制缺血性脑卒中后铁死亡及其作用机制，以Nrf2的抗氧化功能为着眼点，从基因角度进一步阐述了铁死亡对缺血性脑卒中的影响。然而，本篇文献还存在着以下局限性：除了Keap1-Nrf2/ARE，Nrf2还存在着其他的激活通路，经其他途径激活的Nrf2是否可以抑制铁死亡目前尚不清楚；现关于Nrf2抑制缺血性脑卒中铁死亡的直接实验研究和临床报道均较鲜有，故本文仅为理论上的合理阐述，缺乏具体实验研究支持。因此，在未来的临床研究中，应积极探索Nrf2是否可以成为抑制缺血性脑卒中后铁死亡的突破点，从而为今后缺血性脑卒中的治疗提供新的线索。