mcr基因介导的多黏菌素耐药机制研究进展

张琳慧，苏梦茹，王 卓，王 娟

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100)

抗生素广泛使用导致细菌耐药问题日趋严重，细菌耐药性成为21世纪人类和养殖业的最大威胁之一[1]。如携带抗多黏菌素基因mcr(mcr1-9)的大肠埃希氏菌等不断被报道，甚至在临床培养的大肠埃希氏菌菌株上也分离出来mcr-1基因。细菌对于多黏菌素的耐药性被认为是与染色体突变有关，而由质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1可在同一菌种或不同菌种间水平传播。研究mcr-1基因的来源特征与抗多黏菌素耐药机制之间的关系，对评估mcr-1基因的传播和深入研究耐药菌的耐药机制和存活方式有参考价值。

1 mcr基因特征及其介导的耐药机制

1.1 mcr-1基因的发现及分布

当微生物长期暴露于不同抗生素下，细菌的基因容易发生突变，即产生抗菌抗性(AMR)。对肠埃希氏菌科细菌耐多黏菌素研究中，部分耐药菌株却未测得耐药基因(pmrAB,phoPQ和mgrB)阳性，在进一步接合转化试验中质粒的转移使受体菌获得多黏菌素耐药性，对该质粒进行全序列测序，并命名为mcr-1，它是一种质粒介导肠杆菌科细菌免受黏菌素的侵害，改变细菌对抗生素敏感性的基因[2]。细菌的耐药性产生是通过染色体突变的形式，由于染色体突变的随机性，耐药菌在理论上不会出现大规模的增殖和富集，而mcr-1基因被发现后，该基因是由质粒介导在菌群间水平传播，极大地增加了耐药性传播的风险性[3]。mcr-1的发现引起世界各国对该基因的重视，有38个国家/地区分离出mcr-1阳性样品，有的国家/地区已发现mcr-1的变异体mcr-2；非洲有突尼斯、埃及、阿尔及利亚、尼日利亚和南非；北美洲的加拿大和美国，南美洲阿根廷、厄瓜多尔和巴西以及澳大利亚等国家也有mcr-1的报道[4]。

对猪场粪便样品耐药菌株检测中发现122份样品有86株耐药菌株，经PCR检测出63株mcr-1阳性菌株(均为大肠埃希氏菌)[5]，耐药发生率和mcr-1阳性率分别高达70%和51%。猪场中高耐药发生率说明抗生素的滥用已经引起了严重的细菌耐药问题，猪场检测样品mcr-1基因高阳性率表明猪场很可能是此耐药基因的发源地，并且猪场生产过程中已经有一定程度的流行，大肠埃希氏菌是其传播的主要载体，可实现不同亲缘关系菌株间的传播。鉴于猪场的mcr-1基因的广泛流行和传播，进一步对猪场相关产品的流向线索分析，监测动物产品，贯穿猪场的水源，污水废水以及周围土壤mcr-1基因的阳性率，结果显示在猪场的各个环节中已经有大量的mcr-1基因，且泥土中含量较大[6]。说明动物体内大肠埃希氏菌携带的mcr-1基因已经向周围环境扩散，且可长时间积聚于环境中。由于猪场mcr-1基因的流行情况，在其他畜产品生产过程中也应定期监测mcr-1耐药基因的阳性率，重点监测流动性较差的相关物品，分析比对数据，追溯耐药性传播的源头，做好污水污物无害化处理，延缓耐药性的传播和发展。

1.2 mcr-1基因的序列多样性及其变异体

mcr-1基因全长1 626 bp,G+C含量49%。预测该基因编码mcr-1蛋白，由N-末端的5个跨膜域和催化域组成，跨膜区和底物结合位点作用从而改变菌株的耐药特性[4]。在mcr-1基因的研究中发现了一种新的多黏菌素耐药基因mcr-2，与mcr-1一致性为76.75%，其序列的基因环境也非常相似，同样插有插入元件IS1595超家族和297 bp的开放阅读框(ORFs)编码以及与mcr-1基因编码蛋白相似的蛋白[7]。mcr-3、mcr-1和mcr-2仅有45.0%和47.0%的核酸序列和氨基酸序列一致性。但在多黏菌素耐药性表达上mcr-1变异体与mcr-1无明显差别[8]。mcr-3发现不久，mcr-4也被发现。已经发现了10种mcr家族基因(mcr-1～mcr-10)[9]，作为mcr-1的变异体，其在细菌间水平传播和引起多黏菌素耐药性也应引起注意。

1.3 mcr-1的传播及耐药机制

该基因突破了人们对细菌耐药性主要由染色体突变引起的认知，其在不同菌株之间基因转移方式也不同，mcr-1由可携带基因质粒所介导转移或是仅其上游序列单独转移。mcr-1基因主要位于IncI2、IncI1、IncHI2、IncHI1、Incp、IncX4、IncFI、IncFII、IncN和IncK等不相容分型的细菌质粒上，以IncI2和IncK最为常见[4]。mcr-1由宿主质粒介导传播，可通过接合试验或者转化试验将大肠埃希氏菌中的mcr-1转移到其他菌株，接合子的MIC值在某些菌株上可能也会出现变化，mcr-1基因既可在肠杆菌科中传播，也可传播到肠杆菌科外的细菌，基因水平上可以在大部分自然界微生物中移动和通过生物链传播，导致多黏菌素耐药率增加。

多黏菌素是阳离子多肽，包括5种化学结构不同的复合物(多黏菌素A～E)[4]。其作用机制主要是与革兰氏阴性菌外膜中带有负电荷的脂多糖(LPS)相互作用破环细菌细胞，而多黏菌素耐药大多数与LPS的修饰有关，以前认为耐药性是染色体突变引起，是由染色体介导的双分组信号调节系统失调(如PrmABh和phoPQ)及其特异性突变引起[10]。直到发现了质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1具有与细菌内磷酸乙醇胺转移酶家族相似活性，磷酸乙醇胺基团(PEtN)可以在其转移酶的作用下转移到LPS的类脂A上，其编码的mcr-1蛋白跨膜域能够固定于细胞内膜并且一定程度上改变细胞膜的构象，在细胞周质中也可以完成对LPS的共价修饰，导致LPS的净负电荷降低使细菌与带正电的多黏菌素静电作用降低，引起耐药性的发生[11]。

2 mcr-1基因的阳性率与动物和环境的关系

mcr-1基因多由大肠埃希氏菌携带，在多个国家(地区)多种样品中检测到mcr-1阳性，样品来源包括人和其他动物肠道、排泄物、动物性食品(肉、牛奶及乳制品等)，动物生产排放的污水、废水、各地河流土壤、海洋、水产养殖、多种新鲜蔬菜及粮食生产的不同阶段。mcr-1已广泛存在于环境中。

2.1 动物及动物产品mcr-1基因的高发生率

在比利时的一项研究中分析了多种动物源的大肠埃希氏菌耐药分离株[12]，100%的分离株至少携带1个可移动性mcr基因(mcr-1～mcr-9)，其中mcr-1基因最常见。在1个小牛犊分离株同时检测到了3种mcr基因(mcr-1、mcr-3和mcr-5)，并且3种基因由3种不同的质粒携带，该分离株对12种抗生素具有耐药性。如果该菌株在医学临床引起致病性，将存在极大的潜在医疗风险。在对比来自于不同地域的4株分离株mcr-1图谱时，mcr-1基因没有表现显著的克隆性，但对其相似的多黏菌素的抗药性分析，可能是mcr-1基因部分序列控制对多黏菌素的耐药性，在水平传播中发生基因重组现象，也有可能出现基因突变产生基因差异。mcr-1基因突变让人担忧其他更严重的未知耐药性的产生，在发现耐药菌株时最好进行全序列测序，监测mcr-1基因的同时也应关注mcr-1相似序列基因及其表达产物，是否对其他抗生素出现耐药性。可由亲缘关系较远的大肠埃希氏菌中不同质粒(对于mcr-1)所介导，也印证了mcr-1基因可在不同科属间水平传播，该基因如何在不同质粒间转移值得进一步研究。

有报道从78%的生牛肉和53%的即食牛肉中分离出了大肠埃希氏菌，3.8%菌株带有mcr-1基因[13]。mcr-1基因已经存在动物食品中，食品污染途径主要有两种，环境污染和本身携带有该种细菌。由于发展中国家抗生素监管机制和屠宰环境卫生保证较发达国家有待改善，更应加强对mcr-1的检测。全球一体化的发展和物流贸易，动物产品大范围流通使耐药基因成了一个全球性问题。在中国一例腹泻儿童中发现与其他区域高度同源的mcr-1基因[14]，这说明该基因已经实现跨区域传播，未来在进出口贸易中应更加深入监测。

在检查一批初产没有乳腺炎病史的荷斯坦奶牛时[15]，取20头奶牛的牛奶样品并观察乳头皮肤微生物菌群，分离培养出大量的革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌是mcr-1基因的良好载体。乳头皮肤分离培养出大量的革兰氏阴性菌说明在牛乳制品中也存在同种细菌，全球每年都要消耗数以亿吨的牛奶，如果牛奶作为耐药基因从动物传播到人，其流行规模将难以控制。虽然目前尚未在牛乳制品中检测到mcr-1，但分离出大量革兰氏阴性菌，在之后的生产中还需要密切关注检测牛乳制品的微生物含量。

在孟加拉国家禽肠道中也检测到mcr-1基因[16]。在多个国家(地区)无论是活体动物、食用动物和动物产品中，都检测出了mcr-1基因，表明其已经在动物及其相关产品中传播，进一步也会通过食物传播给人类[17]，人们在食用了这种食品后如果引发耐药菌株感染，多黏菌素也即将失效，将面临无药可用的地步。

2.2 mcr-1阳性基因在自然环境中的分布

mcr-1阳性基因在污水废水中存在比较集中[18]。在中国台湾对淡水系统mcr-1阳性大肠埃希氏菌分布的研究中[19]，分别在不同区域采样发现mcr-1阳性大肠埃希氏菌占5.9%，约71%阳性样品来自河的下游地区，阳性分布率与中国台湾沿河地区的畜禽密度显著有关。中国台湾的自然环境已经被mcr-1阳性细菌所污染，耐药菌株的分布与家畜种群密度呈正相关，表明河流中mcr-1阳性大肠埃希氏菌的污染很有可能来源于人为活动，是存在于畜群中的mcr-1基因向周围环境传播或者未经无害化处理的养殖污水废水导致了河流的污染。对河流分离细菌株进一步分析，对携带河流菌株mcr-1基因的质粒与畜禽养殖场中分离的mcr-1基因的质粒进行测序比较，4种细菌抗性是同一种质粒编码，2种不同来源的质粒表现出了显著的相似性，表明自然环境中的mcr-1基因是来源畜禽养殖。

2.3 mcr-1基因在食物链中的传播

畜禽养殖场是mcr-1基因的发源地，养殖场产生的排泄物、废水进入土壤引起水源污染，该基因可通过水资源积聚于植物中，进而扩散到草食动物和肉食动物中，最终传播到人类。若不加以控制，mcr-1基因可通过食物链的传播，遍及植物、动物和自然环境，导致生态系统更大范围内细菌耐药性。在中国的一项常规监测中[20]，从猪肉产品中分离出了一种高度可转移的质粒介导的大肠埃希氏菌抗性基因mcr-1，与临床住院的患者分离出的耐药株进行测序比较，发现其中有1%带有这种新的耐药基因。表明动物源mcr-1基因已经通过食物链的传播导致了临床病例耐药性的发生。

3 mcr-1基因的传播风险和遏制策略

3.1 mcr-1耐药基因流行风险

mcr-1阳性基因已经在我国养殖场中广泛流行，其中以质粒介导的水平传播为主[21]。mcr-1基因以质粒为载体实现基因水平上微生物内的广泛传播，通过食物链可以在动植物以及人类大范围流行，具有比其他耐药性更大的流行风险。抗生素曾经作为人类对抗细菌最有效的手段之一，而今耐药基因严峻的流行情况，导致未来的抗生素可能无法再发挥其显著的效果，在面临耐药菌株感染时将会出现无药可用的地步。

3.2 应对策略

3.2.1 控制兽医临床抗生素使用量 禁止黏菌素作为生长促进剂使用后[22]，多黏菌素预混物使用量下降，猪和禽的养殖场中耐碳青霉烯大肠埃希菌病显著下降，人类感染中分离的耐碳青霉烯大肠埃希菌也明显降低。表明控制畜牧生产中抗生素的使用量十分有必要。因此，国家应及时严格控制抗生素的使用量，降低耐药菌株的产生。

3.2.2 加强对抗生素的区域使用监测 掌握抗生素使用的合理数据十分有必要，以区域抗生素使用数据预估常见菌的耐药趋势，为降低耐药性的发生采取适当的干预措施。同时探索经济的抗生素残留物处理措施加以推广，可以有效的减少耐药基因从动物向环境的传播，在一定程度上也阻断了耐药基因通过生物链传播。

3.2.3 防止感染 对当地的监测数据进行合理的临床评估，制定合理的药物使用方案，减少疾病的发生，防止人类和动物的感染，从根源上减少抗生素的使用。

4 展望

随着抗生素使用耐药性问题日趋复杂，抗多重耐药革兰氏阴性菌的防线也即将“失守”。人们首次发现了质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1及其变异体，对其来源、结构、传播机制、耐药机制以及对人类、动物和环境的影响进行了探究。本文就mcr基因的发现分布及其传播和引起多黏菌素耐药性的机制，与人、动物环境的关系和传播风险等研究进展简要综述，以期对多黏菌素耐药性的认识和mcr基因的研究提供参考。