细菌生物被膜形成的调控机制与消除方法

宋雪艳，刘志欢，谢翠萍，刘营营，杨永亚，刘建华

(河南农业大学动物医学院，河南郑州 450002)

细菌生物被膜(biofilm，BF)是细菌黏附在惰性或活性物体表面自行繁殖，并包围在多糖基质、纤维蛋白、脂质等分泌物中，形成具有特殊复杂结构的高度组织化、系统化的膜样聚合物[1]。BF是细菌在紫外线辐射、极端温度或pH、高盐、高压、营养不良、抗生素作用等状态下，形成的自我保护机制[2]。90%以上的微生物可以形成BF，BF可出现于自然、人工及宿主体内等任何生态系统中。在BF的保护下，细菌耐药性、抗吞噬性、致病性及黏附性等均有所提高，导致感染性疾病反复发作，迁延不愈，因此掌握其形成的调控机制，寻找快速有效的清除方法非常必要。本文概括了BF的形成过程及影响因素、结构特性和调控机制，并对目前常用的BF消除方法进行综述。

1 生物被膜形成过程及影响因素

BF的形成是一种动态过程，与胞外多糖的产生、细胞迁移、亚群分化和相互作用密切相关，有黏附、聚集、成熟、脱落四个步骤[3]。首先细菌黏附在物体表面，形成单菌落，并被自身分泌物不断包裹形成微菌落。细菌在非生物表面的黏附主要通过氢键、范德华力、疏水作用力等相互作用；而在组织表面的黏附则主要通过黏附素等分子间的结合作用。细菌在黏附过程中是可逆的，此时BF尚不成熟，对抗生素的抵抗力不强，应用抗生素治疗会取得很好的效果[4]。多糖黏附素是在由ica操纵子功能基因编码的酶催化合成，在不可逆的微菌落聚集过程中发挥主要作用[5-6]。随后，多个微菌落融合并向上生长，并不断聚集，形成成熟的BF，其结构类似蘑菇状。BF成熟后期，随着酚溶性调节肽等物质的作用[7]，部分细菌从BF上脱落下来，进入下一个循环过程。细菌BF成熟后，由于胞外聚合物的屏障作用，膜内菌株的新陈代谢速率会降低，进而形成休眠体，此时菌株相关耐药基因被激活，产生胞外酶[8]，导致了生物被膜菌的耐药。BF形成过程中，细菌的鞭毛、菌毛及其分泌物也有很重要的作用[9]。有研究表明鞭毛介导的泳动及Ⅳ型菌毛介导的蹭动对早期细菌BF的形成意义重大[4,10]。

2 生物被膜结构特性

在自然条件下，几乎所有的细菌都能以BF的形式存在，BF具有独特的宏观及微观结构、不均一性、流体黏滞性和固体弹性等综合性质[11]，可调节其自身结构以适应内部和外部变化，使细菌有很强的耐药性和免疫逃避能力。研究表明，BF由内至外分为基质层、条件层、连接层、生物被膜层。成熟的细菌BF的微菌落间分布有水通道，主要用于运输营养物质和废物。细菌BF的紧密程度、厚薄度及其形态因细菌种类、生长环境、附着表面、营养情况的不同而不同[12]。不同的细菌物种在相同的条件下会形成不同的BF，相同的细菌物种在不同的条件下也会形成不同的BF。如细菌根据环境的不同形成固体或液体等形式的BF[13]，表达不同的耐药基因导致细菌耐药。BF的形成能力与温度和接触材料有一定的关系[14]，25℃相较于37℃、15℃等其他温度，玻璃相较于聚苯乙烯、不锈钢等其他材料，都更有利于形成BF。细菌在BF中占比很少，水分含量可高达97%，其余大多是胞外多糖、核酸、磷脂等成分。连接细菌的细胞外基质组分之间的差异及营养物质多少的变化等都会导致不同结构的微菌落或被膜结构。浮游态和BF状态是细菌的两种不同的生命模式。位于BF不同位置的细菌在体积大小和代谢活性等方面均存在显著差异。BF浅层细菌之间养料、氧气、酶等都很充分，代谢活跃；而BF深层的细菌不易获得养料和氧气等物质，代谢缓慢，细胞分裂很少，体积较小，大多处于休眠状态，对抗菌药物不敏感。位于BF深层的细菌抵抗抗生素的能力是浮游细菌的1 000倍[4]。

3 生物被膜形成的调控机制

细菌生长过程中，会分泌一些物质，而这些物质可以作为生物信号分子，并通过一些信号调控途径在细胞内或细胞间传递信息，使细菌在多细胞水平上协调统一相互配合，以完成一些重要的生理学功能，其中包括BF的形成。这些信号调控途径主要有群体感应系统、环二鸟苷酸系统和多糖调控系统等。

群体感应系统是细菌产生和检测信号分子的过程，并以细胞密度依赖的方式来协调它们的行为，可调控BF的形成。其信号传递分子即自诱导因子，能感知周围同类细菌的密度，并根据细菌密度的增加而增加。当增加到一个临界浓度时，群体感应系统信号调控胞外多糖、黏附素、表面活性剂等物质的产生，从而影响BF的形成[15-16]。

研究发现，环二鸟苷酸系统在调控细菌BF形成过程中具有重要作用。BF的形成与环二鸟苷酸系统的浓度有关，当环二鸟苷酸系统浓度低时，细菌的一些运动基因表达增加，不易形成BF；当环二鸟苷酸系统浓度高时，细胞黏附因子的产生会增多，胞外基质分泌也会增加，使细菌更易黏附在细胞或生物材料表面，有利于BF的形成[17]。

多糖是维持BF结构的主要成分，有利于细菌与物体表面的黏附。因而多糖调控系统对细菌BF的形成扮演着举足轻重的角色。如铜绿假单胞菌，其胞外多糖Psl、Pel是Ⅳ型菌毛非依赖性小菌落所必需的，对铜绿假单胞菌BF形成后期的亚群相互作用和大菌落形成必不可少[18-19]。

4 生物被膜清除方法

BF的控制和清除可以从抑制细菌的初始黏附和破坏成熟的BF结构入手，方法主要有物理清除方法、生物化学清除方法、中药清除方法等。

4.1 物理清除方法

控制BF的物理方法有超声波、低电流、紫外灯照射、喷射清洗、高温清洗等。研究显示低频超声单独作用时不能影响BF，但与抗生素联用后，能破坏BF结构，使活菌数量显著降低[20]；电流可以影响细菌BF结构中菌体的数量，且能增强抗生素的杀菌效果。细菌黏附初期是可逆的，所以此时用紫外灯照射、清洗、加热等物理方法，就能够有效清除BF。因此，在生物被膜形成的适宜阶段进行物理清除可取得一定的效果。

4.2 生物化学清除方法

研究表明，金属螯合剂、抗菌药物、抗菌多肽、表面活性剂、过氧化氢、酒精等都可以破坏BF的形成。EDTA是最常见的金属螯合剂，能降低混合细菌的黏附度，抑制BF的形成[21]。当使用单一抗菌药物时，一些细菌会产生各自的耐药机制，进而对该抗菌药物耐药，并形成BF。而当两种或两种以上抗菌药物联用时，能够破坏BF，使BF状态的菌株更容易被杀死。抗菌多肽的分子小、作用机制独特、不易产生耐药性且生物功能广泛，能够降低BF相关基因的表达，阻止细胞外化合物的产生，抑制细菌BF的形成[22]。细菌所要黏附表面的形貌、电荷、官能团类型、粗糙度等都会影响BF的形成。可通过使用防黏性涂层或含药物涂层、具有抗生物被膜和抗菌性能的固有生物活性材料等去抑制BF的形成。

最新研究发现，酶制剂、噬菌体等可用于抑制BF的形成。如酶制剂能靶向作用于BF胞外基质，降解BF中群体感应系统信号分子，阻断细胞间的交流，从根本上清除BF[23]。噬菌体能够感染细菌、真菌、放线菌等微生物，编码胞外多糖解聚酶和裂解酶去破坏BF基质，且自身可以进入BF内部裂解细菌，抑制BF的形成以及破坏已形成的BF[24-25]。所以可根据条件的不同，选择合适的生物化学方法对生物被膜进行清除。

4.3 中药清除方法

中药单一成分或其混合提取物，如黄芩苷、银杏酚酸、鱼腥草素钠、苦参碱、桑螵蛸的脂质提取物、大黄提取物等都有利于BF的清除。研究表明黄芩苷能够改变细菌基因和蛋白质表达[26]，抑制BF形成。黄芩苷单体可以抑制泛耐药鲍曼不动杆菌BF的形成，当其与美罗培南、亚胺培南等抗生素联用后，效果更好[27]。桑螵蛸的脂质提取物可以减少细菌黏附、破坏生物被膜结构、裂解细菌[28]。此外，对生物被膜有抑制或清除作用的中药还有很多。寻找合适的中药及其提取物对生物被膜进行清除有很重要的研究意义。

5 展望

当在极端环境或抗生素作用下，细菌即通过群体感应、环二鸟苷酸等系统的调控，进行黏附聚集等过程，形成成熟BF以进行自我保护，导致耐药性明显增强，且不易被清除，给养殖业、食品行业及人类健康造成威胁。目前对于调控细菌BF形成的机制、如何清除BF等方面尚需深入研究。为了更好地控制BF造成的感染，可以把研究深入到分子水平，寻找更多能够作用BF的抑制剂，并对抑制机制进行深入研究。联合使用物理、生物化学、中药等各种方法，从而彻底治疗细菌BF感染性疾病，以及防止BF对食品加工行业造成污染事件的发生。