单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展

史文静，委慧玲，齐玉梅，孙亚楠，薛慧文，苟惠天

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)(Listeriamonocytogenes,LM)是一种兼性厌氧的食源性病原菌，可以造成很多食品污染，包括酸奶、奶酪、肉类、火腿、烟熏肉、家禽、海鲜和蔬菜产品等[1]。该菌在食品生产和储存过程中(如低pH、冷藏和高盐浓度)都可以存活和繁殖，对即食食品构成严重威胁。感染单增李斯特菌会出现肌肉酸痛、发热、恶心、呕吐、腹泻等症状，严重者表现为败血症和脑膜炎，孕妇发生早产、死产或流产。目前已知单增李斯特菌主要有13种血清型，血清型1/2a、1/2b和4b是引起食源性感染的主要原因[2]。鉴于单增李斯特菌对公共安全造成的严重危害，很多国家对食品中单增李斯特菌的检测限有明确规定。

单增李斯特菌的检测方法有平板菌落计数法、生化试验法、分子生物学检测法和免疫分析法。这些方法灵敏度高，操作性较强，但耗时较长[3]，不适合现场直接检测。检测需经历富集、分离培养、染色镜检、生化鉴定、溶血试验、协同溶血试验等，最终才能分离鉴定出单增李斯特菌[4]。市场需要廉价、快速、可重复和易于使用的方法。因此，越来越多的研究集中在如何提高检测灵敏度和缩短检测时间上。

1 免疫学检测法

1.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种免疫学检测技术，将抗原和抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合[5]。ELISA相对于传统检测方法耗时较短(30 h～50 h)，可用于诊断和检测各种病原微生物引起的传染病和寄生虫病，检测食品中有害成分的残留以及在生物医学等多种领域发挥作用。ELISA的不足之处是抗原抗体反应具有专一性，必须为每个目标物建立特殊的检测试剂和检测方法，检测时需要足量的病原体才能提供有效的结果。

双抗体夹心酶联免疫吸附试验对单增李斯特菌的最低检测限可达1×105CFU/mL，且与常见食源性病原菌无交叉反应[6]。该方法特异性较好，且批内和批间变异系数均小于10%，具有良好的重复性。用单增李斯特菌单克隆抗体和多克隆抗体成功建立的双抗体夹心ELISA，具有良好的灵敏度、特异性和重复性，可为单增李斯特菌的监测提供技术支持。但是，如果在加工或预处理食品时，抗原受到破坏，测试结果的准确性会受到一定影响，且制备单克隆抗体的成本较高。

1.2 荧光免疫分析法

酶联荧光分析法是将抗原与单克隆抗体结合，再将结合有碱性磷酸酶的抗体与相应的抗原结合发生颜色反应[7]。通过检测荧光强度(荧光强度与抗原含量成正比)，可以计算出样品中抗原的数量。酶联荧光分析法比酶联免疫吸附法灵敏，省去显色反应并缩短反应时间，但成本更高。目前主要应用在自动酶联荧光免疫检测系统上。

有研究开发了一种基于新型壳聚糖-纤维素纳米晶体数控(CNC)膜的荧光夹心免疫分析法，提高了细菌生长过程中捕获抗原的能力[8]。与常规方法相比，将CNC膜捕获p60蛋白特异性抗原与荧光检测相结合，使分析时间从24 h降到12 h，检测限低至1×102CFU/mL。此外，用单克隆抗肽类药物共价固定在CNC膜上，保证了该方法的高特异性。且荧光检测灵敏度高，允许在12 h内进行单增李斯特菌的检测，与其他5种常见的食源性病原菌(沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌)无交叉反应。荧光免疫分析法的主要不足是应用范围小，自身能够发出荧光并形成荧光测量系统的物质相对较少。

1.3 免疫磁性分离技术

当食物样本中目标细菌的数量较少，且由于食品成分的背景干扰和非目标菌群的负面影响，对食品样品进行李斯特菌的检测很难得到准确的结果。因此，建立高效的前处理技术对食品微生物的检测至关重要。基于免疫磁颗粒(IMPs)的免疫磁性分离(immunomagnetic seperation，IMS)技术具有特异性高、分离效率高的显著优势，是一种分离富集靶菌的强大体系。

一种基于生物素暴露的IMS与核酸横向流动生物传感器相结合[9]，当细菌数量低于1×104CFU/mL时，可捕获到90%以上的单增李斯特菌，且抗体的使用剂量大大减少。用生物素接触IMS结合十二烷基硫酸钠(SDS)、叠氮溴化丙啶和多重实时PCR快速、灵敏地检测牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的方法[10]。添加牛奶基质样品中的金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的检测限为10 CFU/mL，整个检测过程在9 h内鉴定出活菌。IMS预处理可以提高靶菌浓度，与各种检测方法(基于免疫学的方法、基于核酸的方法、荧光的方法、生物传感器等)相结合，可有效缩短分析时间，提高检测灵敏度，在食品细菌检测领域具有广阔的应用前景。在未来的研究中，除了抗体外，还需要寻找具有较强亲和力和识别性的活性配体。消除食品成分对IMS的干扰，建立标准的操作程序，对提高某些食品中不同微生物的富集也至关重要。

2 分子生物学检测方法

2.1 环介导等温扩增

环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是一种有效的病原体特异性分子生物学检测方法。LAMP反应是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，恒温条件进行扩增[11]。LAMP 是一种创新的基因扩增工具，简单，无需复杂的设备进行热循环，所有链置换反应发生在等温条件下，但其固有缺点是不能区分活菌和死菌。

磷脂酰胆碱-磷脂酶C基因的LAMP，通过形成DNA复合物和金纳米颗粒/DNA探针复合物进行比色检测[12]。整个检测过程可在1 h内完成，方法简单、设备独立，通过比色可视化快速定量，表明对即食食品现场检测的可能性。用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测肉类中的单增李斯特菌，证明RT-LAMP技术可以区分活菌和死菌[13]。在最佳条件下，RT-LAMP扩增产物在60 min内可见白色沉淀。市场上的肉制品上有时会附着大量的死细菌，当使用LAMP时，可能会出现假阳性结果，RT-LAMP可以准确的检测出活菌，可以避免因食品中存在死菌而导致假阳性结果。随着研究的深入，LAMP与其他方法联合使用，使反应条件和准确性得到了优化和提高，拓宽了LAMP技术在实际疾病临床诊断中的应用，促进了试剂盒的生产，对感染性疾病的监测和控制具有重要意义。

2.2 表面增强拉曼散射

表面增强拉曼散射(surface enhanced raman spectroscopy,SERS)是一种新型的光谱快检技术[14]，由于其快速、无损，不需要样品制备等优点，在生物和化学分析中具有广阔的应用前景。该方法分为直接SERS，间接SERS以及SERS与其他技术结合，目前使用最多的是SERS与其他技术结合以检测食源性致病菌。

磁辅助SERS标记免疫测定法，用游离抗体标记和葡萄球菌蛋白A(PA)-SERS标记定位识别的方法对细菌进行检测[15]。该方法快速、可靠、操作方便，在食品安全监测和传染病诊断方面具有很大的潜力。SERS的侧流生物传感器，结合聚合酶扩增可检测单增李斯特菌和肠道沙门氏菌[16]。核壳纳米粒子被用于SERS-LF，通过测量SERS标记的特征峰强度，实现了高灵敏度的定量检测。在最佳条件下，单增李斯特菌的检出限为27 CFU/mL，肠道沙门氏菌的检出限为19 CFU/mL。因此，SERS与其他技术结合可以快速、定量检测食品中多种细菌病原体，并可以提供单分子水平的无损检测和超灵敏检测，具有较高的特异性和适用性。

2.3 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)因其具有灵敏度高、特异性好等优点，成为很有前景的检测方法。与LAMP相比，它需要更低的反应温度和更少的底物。

基于RPA技术的单增李斯特菌快速检测方法[17]，针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物，通过优化反应体系，实现了单增李斯特菌的快速检测。 重组酶聚合酶等温扩增结合侧流试纸条(RPA-LFS)体系检测单增李斯特菌[18]消除了引物二聚体中的假阳性信号，可在25 min内完成检测。RPA在37℃～42℃扩增目标DNA，不需要热循环，对单增李斯特菌有较高的特异性，其灵敏度高于LAMP检测限，可与基于PCR或qPCR的方法相媲美。重组酶聚合酶等温扩增与其他检测技术联合使用具有速度快、灵敏度高、对设备和培训人员的依赖性小等优点。然而，其简单性带来了内在的、不可忽视的风险，即引物二聚体发出的假阳性信号，因此克服该缺点将会大大提高该方法的应用。

3 生物传感器

3.1 电化学生物传感器

生物传感器经过多年的发展，凭借其灵敏度高，选择性好，准确度高且成本低，被广泛应用于食品中微生物的检验。一种基于plcA基因的电化学DNA生物传感器，用循环伏安法和电化学阻抗法检测单增李斯特菌[19]。采用固相萃取技术，将-NH2固定在ssDNA探针上，与目标DNA进行杂交。该传感器的LOD低至13.7 fg/μL。与已有的生物传感器相比，具有较低的检测限。一种新型电化学生物传感器可同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌[20]。该生物传感器用两种细菌产生的蛋白酶对特定肽的水解活性，不需要DNA提取或扩增技术，在1 min内即可完成检测。有研究构建了一种快速检测细菌的电化学生物传感器，该传感器基于电极间银丝的简易合成，选择细菌的16SrRNA高变区作为标记基因。引入电化学信号，提高电化学检测的灵敏度。这种新型电化学生物传感器具有结构简单、速度快、信噪比高等优点，在食品安全监测和临床诊断中具有广阔的应用前景。电化学生物传感器可以利用不同类型和形式的纳米材料或纳米复合材料，通过不同的策略提高检测机制的灵敏度，提供更好的检测限。

3.2 其他传感器

一种基于磁小体的生物传感器用于从食物样本中快速、灵敏、特异地检测单增李斯特菌[21]。通过提取磁小体，直接与抗李斯特菌溶血素抗体结合，后经光谱确证。该传感器在水和牛奶样品中的检出限均为101CFU/mL，显示了该传感器的灵敏度。用一次性电极作为表面换能器，特异性识别单增李斯特菌p60蛋白和李斯特菌的单克隆抗体和多克隆抗体，该免疫传感器已成功地应用于加标牛奶样品，为食物中单增李斯特菌的实际检测提供了一种可行的方法。用基于生物电识别分析的细胞生物传感器技术和EMBIO公司开发的便携式设备(生物电诊断设备) ，将单增李斯特菌同源抗体插入非洲绿猴肾细胞膜进行膜工程[22]。该生物传感器能够在浓度低至102CFU/mL的情况下3 min快速检测病原体，比大多数现有的基于生物传感器的方法具有更高的灵敏度。此外，与其他李斯特菌以及大肠埃希氏菌没有交叉反应，这表明生物传感器对单增李斯特菌具有显著的特异性。研究发现，生物传感器方法的优点包括功能多样、成本低、识别率高、灵敏度高、智能化、微型化等，故成为食品安全快速检测研究领域的重点研究对象。

4 结论

近年来，由单增李斯特菌引起的食源性疾病逐年增多，人们对该菌的检测和防控愈发关注。传统检测方法准确，但耗时较长，且在实际应用中受制较多，因此人们致力于研制该菌的快速检测技术。免疫学方法简便快捷，对抗体制备具有较高要求，易受其他杂菌干扰。分子生物学法快速、准确，但是生物标记的成本较高。生物传感器具有灵敏度高、选择广泛、速度快、实时检测和无损传感等优点，但检测成本也是居高不下。以上技术虽有诸多弊端，但是随着科学技术的发展，它们将得到不断完善。特别是随着近年来不同学科之间融合加强，相信将有更多的快速检测技术会被应用到单增李斯特菌的检测中来。