钩吻素子抗炎作用研究进展

杨梦然，毛 妍，梁曾恩妮，邬 静,2,3，袁志航,2,3*

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128；2.湖南畜禽安全生产协同创新中心，湖南长沙 410128； 3.湖南省兽药工程技术研究中心，湖南长沙 410128；4.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南长沙 410125)

钩吻是马钱科胡蔓藤属一年生木质藤本植物，又名胡蔓藤、断肠草、猪人参等，是有毒植物，对人体有剧毒，钩吻广泛分布于美洲和亚洲，亚洲钩吻主要产地为东南亚地区及我国湖南、云南、福建等长江以南省份的山地灌木丛或潮湿的丘陵，它不仅具有祛风散淤、消肿止痛和杀虫的功效，还具有抗炎镇痛、抗肿瘤、调节免疫等多方面作用[1-2]。钩吻的主要活性成分为吲哚类生物碱，包括钩吻素甲(gelsemine)、钩吻素子(koumine)、钩吻绿碱(gelsevirine)、钩吻素己(gelsenicine) 等，其生物碱因具有抗炎抗氧化等生物活性而在药物研究领域占有重要的地位[3]。钩吻素子作为含量最高的生物碱，因其具有低毒高效的特点，已被广泛用于抗炎镇痛[4]、抗焦虑[5]、抗肿瘤[6]等。

炎症可导致动物免疫系统失衡，并对组织细胞产生损害，轻则造成生产性能下降，重则导致全身性的炎症反应，引起动物的采食量降低，体重下降，器官衰竭甚至死亡[7]。因此，寻找有效抗炎作用的中草药来控制和治疗动物炎症性疾病对畜牧业生产有重要意义。

钩吻素子被证实有较好的抗炎作用，对阿尔兹海默症、银屑病、类风湿性关节炎、神经疼痛等有较好的治疗作用，其发挥抗炎镇痛作用的机制主要涉及到核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体、免疫调节、氧化应激、细胞因子、核转录因子(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路、转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路等多方面，本文就钩吻素子抗炎作用的研究进展进行综述。

1 调控NLRP3炎性小体功能

NLRP3炎性小体是由多种蛋白质组成的复合体，在多种疾病的发生中起着关键作用。当受到多种病理因素刺激时，NLRP3炎性小体即可被激活，凋亡相关斑点样蛋白发生寡聚化，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1，使白细胞介素-1β前体成熟，分泌炎性细胞因子从而诱发炎症反应。阿尔兹海默症属于神经退行性疾病，是由β-淀粉样斑块的过度累积造成的神经性炎症，NLRP3炎性小体在阿尔兹海默症中发挥了重要作用。钩吻素子能够通过抑制海马星形胶质细胞和小胶质细胞活化，降低肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎症细胞因子水平，从而抑制NLRP3炎性小体功能，最终减轻阿尔兹海默症的症状，增强大鼠学习记忆能力，表明钩吻素子抗炎作用与调控炎性小体功能有关[8]。钩吻素子能够抑制ROS/NF-κB/NLRP3信号通路发挥抗炎作用，显示出钩吻素子在NLRP3炎症小体相关疾病的防治中具有潜在的临床应用价值[9]。

2 免疫调节作用

炎症反应与免疫反应密不可分,炎症过程中往往伴随着免疫反应，剧烈的免疫反应亦可诱导炎症的发生，二者相辅相成。炎症反应过程中，某些免疫细胞会分泌炎性细胞因子，调节炎症过程。因此，抗炎药物在抗炎过程中往往与免疫调节作用密切相关。钩吻素子能上调脾脏中调节性T细胞的数量，维持辅助性T淋巴细胞1,辅助性T淋巴细胞2,辅助性T淋巴细胞17及调节T细胞的生理稳态，使Th细胞分泌的细胞因子保持平衡，从而发挥治疗类风湿性关节炎的作用[10-12]。钩吻素子能抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂，控制表皮细胞过度增殖[13]。通过检测小鼠血清中IL-2的水平，发现钩吻素子能降低IL-2的水平，抑制T淋巴细胞过度活化，减轻炎症水平从而达到抗银屑病的效果。经钩吻素子处理大鼠，其CD4+/CD8+T细胞的比例显著增加，肝脏中辅助性T淋巴细胞1(Th1)和辅助性T淋巴细胞17(Th17)的百分比降低，辅助性T淋巴细胞2(Th2)和调节性T细胞数量增加，使肝脏中IL-6、IL-1β和TNF-α的产生及其mRNA的表达水平受到抑制，表明钩吻素子通过抑制外周免疫器官中的促炎细胞因子来防止非酒精性脂肪性肝病中慢性炎症的发生[14-15]。

3 调控氧化应激

氧化应激是指机体的氧化与抗氧化作用处于失衡状态，氧化中间产物在机体内过度蓄积。适度的炎症反应对机体产生保护作用，当炎症反应过度时，机体的抗氧化能力受损，从而引发氧化应激。因此，调控氧化应激对抵抗炎症有着积极作用。钩吻素子在上调LPS诱导的猪小肠上皮细胞机械屏障相关蛋白中紧密连接蛋白、闭合蛋白、封闭蛋白的表达水平，增强肠道机械屏障功能的同时，提升过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，减轻氧化应激，从而控制肠道炎症，对畜牧业生产有重要意义[16]。

活性氧的过度释放将导致氧化应激的发生，对细胞的生长产生抑制作用。在肝癌的治疗过程中，钩吻素子能促进活性氧的产生抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡，发挥抗肿瘤作用[6]。钩吻素子可明显降低活性氧释放，提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽活性，降低乳酸脱氢酶水平和丙二醛含量。同时，经钩吻素子预处理的猪小肠上皮细胞，其线粒体功能障碍得到改善，Bcl-2相关X蛋白/B细胞淋巴瘤-2基因的比值减小，caspase-9和caspase-3的激活受到抑制。钩吻素子能够抑制过氧化氢刺激的线粒体凋亡途径，抑制过氧化氢诱导的猪小肠上皮细胞氧化损伤从而减轻肠道炎症，表明钩吻素子能够减轻氧化应激诱导的炎症反应[17]。

钩吻素子对真核微生物有一定的毒性，它能够诱导真核微生物发生氧化应激。在钩吻素子对真核生物嗜热链球菌的毒性作用研究中发现，钩吻素子可剂量依赖性地抑制嗜热链球菌的生长和生存能力。一定剂量的钩吻素子可使嗜热链球菌细胞的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性以及丙二醛、活性氧含量发生显著变化，引起嗜热链球菌细胞氧化应激，并最终导致细胞凋亡，同时伴随DNA损伤水平的增加，引发细胞毒性作用，从而对真核生物嗜热链球菌引发的炎症具有保护作用[18]。

4 调控细胞因子

细胞因子是由免疫细胞和一些非免疫细胞分泌的小分子蛋白质，具有较为广泛的生物学活性，炎症的性质及其持续时间主要是由细胞因子进行调控的。炎症发生过程中，机体产生各种促炎细胞因子，诱导炎症反应的发生，损害机体健康。神经性疼痛促进神经胶质细胞释放趋化因子和促炎细胞因子，诱发神经炎症[19]。在小鼠的神经炎症性疼痛模型中，钩吻素己和钩吻素子均能减轻慢性收缩损伤小鼠的神经性疼痛。钩吻素子能通过诱导自噬和抑制凋亡来抑制星形胶质细胞的活化，减少促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的产生，以达到缓解神经炎症性疼痛的目的[20-21]。

在钩吻素子抗术后疼痛研究过程中发现，钩吻素子能够调控术后疼痛引起的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的过度释放从而减轻疼痛[22]。钩吻素子能够通过调节IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子的产生来达到减轻小鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎的作用[23]。用完全弗氏佐剂诱导类风湿性关节炎，并分别在急性期和慢性期给予钩吻素子进行治疗，其抗炎镇痛作用显著，但在急性期进行治疗效果更佳，且其抗炎机制与抑制细胞因子的释放有关[24]。

通过给佐剂诱导性关节炎和胶原诱导性关节炎大鼠灌胃一定剂量钩吻素子，可减弱IL-1β和TNF-α的表达，降低免疫应答过程中产生的血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体水平。在患有佐剂诱导性关节炎的大鼠中，钩吻素子剂量依赖性地降低了注射了完全弗氏佐剂后爪的关节炎指数评分和机械异常性疼痛，并显著减轻了胸腺和肝脏的重量；在患有胶原诱导性关节炎的大鼠中，钩吻素子剂量依赖性地抑制了后爪体积、关节炎指数评分和机械异常性疼痛，并使关节间隙狭窄得到改善，从而减轻关节炎症。这些结果表明，钩吻素子可通过调控细胞因子减轻大鼠佐剂诱导性关节炎和胶原诱导性关节炎[25]。

5 调节神经甾体

神经甾体是由脑组织细胞合成的甾体激素，在发生神经炎症性疼痛的过程中，上调脊髓中神经甾体的含量可产生显著的镇痛作用[26]。用钩吻碱甲、钩吻素子和甘氨酸处理神经元的原代培养物，可剂量依赖性地增加3α-羟基类固醇氧化还原酶的基因表达，当用士的宁预处理时会抑制3α-羟基类固醇氧化还原酶的表达。大鼠鞘内注射钩吻碱甲、钩吻素子和甘氨酸，可刺激大鼠脊髓中3α-羟基类固醇氧化还原酶基因的表达，并产生机械性抗炎镇痛作用，士的宁、选择性3α-羟基类固醇氧化还原酶抑制剂醋酸甲羟孕酮、3α-羟基类固醇氧化还原酶基因沉默剂小干扰RNA、特异性γ-氨基丁酸受体拮抗剂异孕烷醇酮均能抑制这种抗炎镇痛作用，表明钩吻碱甲和钩吻素子是甘氨酸受体的正构激动剂，并通过神经元甘氨酸受体/3α-羟基类固醇氧化还原酶/别孕烯醇酮/γ-氨基丁酸受体途径产生机械性抗炎镇痛作用[4]。

在大鼠慢性收缩损伤和L5脊神经结扎模型中，钩吻素子对热痛觉过敏和机械异常性疼痛有缓解作用。钩吻素子能促进慢性收缩损伤模型中神经甾体如别孕烯醇酮的释放，抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化，干扰炎症介质的释放，对神经炎症性疼痛有治疗作用，钩吻素子只对组织损伤区域有局部作用，在抗炎镇痛过程中不易产生耐受性，具有良好的应用前景[27-28]。

6 抑制核转录因子激活

NF-κB是经典的炎症信号通路，当受到炎症等外界因素刺激时，NF-κB信号通路被激活，Iκ-B发生磷酸化，NF-κB也发生磷酸化进入细胞核，促进炎症因子的释放介导炎症反应。Wu等通过研究发现，钩吻素子能显著降低LPS的细胞毒性，通过激活Nrf2-keap1抗氧化应激通路，促进其下游元件血红素氧合酶1和超氧化物歧化酶的转录，从而抑制NF-κB通路的激活，减少炎症因子的释放，维持猪小肠上皮细胞的通透性，对LPS诱导的肠屏障功能障碍起到保护作用[29]。

7 抑制MAPK通路

MAPK能将信号从细胞表面传递到细胞核内部，与炎症、肿瘤等疾病的发生密切相关。当受到胞外因素刺激时，MAPK通路可被激活，增加TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，引发炎症，抑制MAPK通路可阻断炎症反应的发生。将小鼠巨噬细胞(RAW264.7)先分别用100、200、400μg/mL的钩吻素子预培养，1 h后用1μg/mL的LPS处理，发现钩吻素子对RAW264.7细胞的生长无影响，且钩吻素子能够抑制LPS诱导的的活性氧水平升高，通过调控p38 MAPK和ERK MAPK通路，抑制p38和ERK的磷酸化，而JNK的磷酸化不受影响，使LPS诱导的RAW264.7细胞中 TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子和一氧化氮等炎性介质的表达减少，具有良好的抗炎效果[30]。

8 展望

钩吻记载于《本草纲目》等众多药学专著中，其主要的生物活性成分为钩吻生物碱。钩吻素子抗炎作用机制研究已经进入细胞分子水平，但由于炎症涉及到的信号转导途径较多，其在基因水平和受体方面的研究仍然不足，钩吻素子抗炎的作用机制尚未完全清晰。钩吻素子能有效抑制巨噬细胞体外炎症反应，推测钩吻素子能通过抑制肠道过度炎症反应，预防腹泻，维持肠道健康，使动物正常饮食，食物消化和营养吸收良好，从而维持和促进动物生长。钩吻素子能够调控LPS诱导的细胞内活性氧水平和过氧化氢诱导的细胞内Ca2+的过度释放，提示在钩吻素子抑制炎症的反应过程中，内质网应激可能参与其中。但是钩吻素子对动物肠道炎症反应的抑制效果，内质网应激是否参与了钩吻素子的抗炎作用及机制仍有待进一步研究。