猪圆环病毒2型的基因复制机制与潜在跨动物种属感染研究进展

杨卓霖，王玥婷，逄国梁，张秀萍，季天润，康煜坤，郭抗抗*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省畜牧技术推广总站，陕西西安 710016)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是迄今发现的突变率最高的单链DNA病毒之一。这种能力使其能够不断地产生大量突变，为适应和逃避宿主免疫系统提供新的机会[1]，这样的高突变率也同时带来了潜在的跨种属感染可能性。1991年，在加拿大发现并确认PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病原，随后在世界各养猪国家均有猪只感染PCV2的报道，并呈现广泛流行趋势。研究表明，仅用PCV2分离株感染试验猪时并不能诱发其出现PMWS完全的临床表现，而当PCV2与其他传染性或非传染性病原共同感染试验猪时，才能导致特征性的临床症状出现，因此推测PCV2是造成临床疾病的必要非充分因素。PCV2感染猪会出现免疫系统抑制，对疫苗的反应性降低甚至不感应，对多种病原的易感性增高，进而诱发猪圆环病毒病和猪圆环病毒相关疾病，对猪只健康造成严重影响并给养猪业带来巨大经济损失[2]。PCV2基因组为单链副股环状闭合的DNA结构，包含1766/1767/1768个核苷酸，存在11个潜在的开放阅读框(ORF)，其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因组正链上，其余7个ORFs位于负链上。家猪和野猪是PCV2的自然感染宿主，在PCV2致病机制和疫苗研究中的试验动物也大多为猪或猪源细胞。但近年来有研究发现，在其他种属动物中也检测到PCV2的存在，如反刍动物(牛、山羊)、啮齿动物(Balb/c小鼠、Black C57小鼠)、犬科动物(貉、貂)、昆虫(苍蝇、蚊子)及贝类中都检测到PCV2核酸；在人类疫苗、动物疫苗、猪胃蛋白酶及环境水样与空气样中亦检测到PCV2；甚至在人血清、粪便和呼吸道拭子中也发现了PCV2及其抗体，这些发现提示PCV2存在的跨动物种属感染可能，需要开展进一步深入研究。

1 PCV2的基因复制机制研究进展

病毒感染的起始是病毒粒子与靶细胞表面相应的受体结合。病毒粒子表面存在许多微小凸起，这些看似不规则的物质实则为具有完美形状与尺寸的“钥匙”(病毒表面抗原物质)，当这些“钥匙”与相对应的受体物质匹配后，病毒入侵细胞的大门便打开来。而受限于细胞膜的特殊结构，病毒需通过内化进入细胞，待病毒粒子的拆解完毕后，进入细胞核并利用所感染细胞中如核糖体等“机器”开启复制、转录以及装配等“工业化”的流程，产出新的病毒粒子并从被感染细胞中释放以感染新细胞。而在整套感染流程中，病毒遗传物质的复制与转录过程是病毒粒子建立感染至关重要的一步。

1.1 细胞受体

病毒与宿主细胞表面受体的结合是建立感染的第一步，多数情况下这一步决定了病毒对细胞兼或组织的趋向性与致病作用。硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素B是目前已知的宿主细胞PCV2黏附受体，同时两者也是大多数病毒与相应靶细胞构建连接时所涉及的氨基葡聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)，在很大程度上与固着在所有类型细胞质膜上的糖蛋白有联系[3]。由ORF2所编码的Cap是构成PCV2二十面体病毒衣壳的唯一结构蛋白。因此，它在参与病毒附着的同时也包含了大多数的表位决定因素，在生物学上起着关键的作用。因Cap具有抗原性及辅助感染的作用，目前对其上的受体结合区有多种研究，氨基酸序列分析表明Cap含有一个可能的肝素结合基序，但此基序并不位于Cap的表面，故将其看作结合区尚存在争议。含有赖氨酸和精氨酸残基的暴露区域可能是更合适的结合区域。随着对PCV2的研究不断深入展开，流行毒株也在发生变异。对2008年-2019年比利时PCV2感染猪组织样本的研究，发现PCV2的大多数氨基酸突变发生在Cap的外侧，并且第232位的极性氨基酸N的突变又使其可以从衣壳表面进一步延伸，通过投射正电荷以增强PCV2与细胞膜上带负电荷的硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素的非特异性相互作用，使PCV2与GAGs受体结合更为紧密[4]。受体的普遍性、Cap基因的高变异性及病毒的结合性提高也为PCV2的跨动物种属感染提供了可能。

1.2 病毒内化

PCV2可通过不同方式进入宿主细胞，其入胞机制依赖于宿主细胞的类型，在病毒转运过程中发生了细胞构象变化[5]。在猪单核细胞系 3D4/31中PCV2的内化作用依赖于网格蛋白，而在上皮细胞系中病毒通过肌动蛋白和Rho-GTP酶进入宿主细胞。在单核细胞、巨噬细胞及单核细胞来源/骨髓来源树突状细胞，PCV2可以驻留其中且不降解或进行复制[6]，尽管PCV2进入此类免疫细胞的确切机制尚不清楚，但可通过PCV2在细胞内的特殊稳定性推测这些细胞可能是PCV2的贮藏细胞。这一特殊性也对为何可以从其他种属动物的组织细胞中检测到PCV2存在这一疑惑带来了可能的解释，而存在于此类贮藏细胞中的PCV2又能否对其他种属动物在组织细胞水平带来一定程度的影响也值得深入探讨。PCV2内化后，Cap与细胞α-微管蛋白和β-微管蛋白相互作用，增强微管的乙酰化作用，Cap的42-100氨基酸可以与动力蛋白结合并沿聚合微管移动穿越细胞质[7]。

1.3 病毒解体

就像PCV2的内化过程那样，不同类型宿主细胞类型中的PCV2解体过程也不完全一样。在猪单核细胞系3D4/31中，PCV2在内体中经酸化后从其中释放，并可与原代猪单核细胞中的溶酶体共存[8]。PCV2病毒粒子同样可以在Cap不解体且不依赖微管的情况下于3D4/31中进行转运。病毒的分解过程中有丝氨酸蛋白酶的参与，而在单核细胞、巨噬细胞、单核细胞来源/骨髓来源树突状细胞中，PCV2不进行解体[6]。

1.4 病毒遗传物质入核

PCV2遗传物质连同Cap及其所招募的P32、蛋白激酶C-δ一同转运入核，Cap在后续的出核过程中也扮演着重要的角色[9]。氨基葡萄糖和DEAE-葡聚糖能够促进PCV2的DNA进入细胞核，实验室增殖PCV2时也常用上述药物来提高病毒增殖效率。尽管目前对于PCV2核酸进入宿主细胞核的具体运输机制尚不明了，但是小直径病毒通常是以完整形式入核[10]。

1.5 病毒核酸复制与转录

PCV2可以在猪源上皮细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维细胞中以滚环式复制机制进行复制，这一机制在细菌质粒、噬菌体和病毒中广泛存在[11]。其复制过程可大体分为单链向多链的转换、复制的启动、脱氧核酸链的延伸以及复制的终止4个步骤。

复制开始前，病毒基因组的单链 DNA转化为双链中间体，继而变为超螺旋分子，以作为病毒DNA合成的模板。PCV2基因组由单链到双链的转化需要一条负链引物来启动互补DNA的合成，同时也需要与Rep复合物相互作用，以诱导构像变化，形成一包含10 bp～12 bp的环和11 bp的回文序列。单链茎形成类似于三重发夹结构的四链结构[11-12]。在DNA0的T6和A7之间的磷酸二酯键断裂后，Rep通过Rep-酪氨酸磷酸二酯键共价连接到DNA0的5′端，并产生一个游离的3′羟基端(DNA0-T6-OH)作为第1轮DNA1的合成引物。尽管感染细胞的胞核中可以检测到Cap的存在[7]，但Cap并不直接参与病毒DNA与Rep相关蛋白的合成[13]，而是通过与DNAJB6相互作用增加自噬小体数量来促进PCV2的复制[14]。

PCV2的DNA复制起始于宿主细胞增殖的第一个S期，由于Rep和Rep′不具备聚合酶活性，初始链的延伸与合成均由细胞酶完成[15]。目前对于PCV2的复制如何终止尚不清楚，有研究提出两种可能的终止方式。在第一种方式中，终止的起点在DNA1合成完毕且DNA0完全移位后，Rep′切开DNA0与DNA1链的Oc8并共价连接到DNA1的5′末端，DNA0也随之生成1个游离的3′羟基端。紧接着刚刚被释放的DNA0游离羟基端对Rep-DNA0复合物的Tyr93进行亲核攻击，进而使得单链DNA0释放；Rep复合物通过Rep′的共价键转移到DNA1链的5′末端。最终生成Rep复合物，单链DNA0以及含有DNA1的复制型双链。第二种假设则认为，在DNA1第1轮合成结束后，进行第2轮复制并生成一段10～12个核苷酸的DNA2。Rep复合物将经历两段切割与连接事件，第一段事件中生成1个单链DNA0，第二段事件中生成含有复制型双链中间物的DNA1以及附有一段回文序列的Rep复合物。因为Rep与Rep′在没有回文序列的情况下依旧具有切割活性，所以在有错配的反向重复序列时并不会形成闭合的单链DNA0，但Rep复合物会释放并与此基因组共价连接[11]。

PCV2有着较为复杂的转录模式。在单链基因组转化为双链基因组后，细胞酶完成RNA的合成。转录双向进行，具有与PCV1相似的转录起始与终止位点(例如Rep；Rep′；Rep 3a,3b；PCV1非编码RNA中的NS462、NS642与PCV2中的NS515、NS672)，并且通过选择性剪接产生RNA[11]。目前已对由Rep、Rep′、Cap、ORF3-RNA、ORF4-RNA、ORF5-RNA、ORF6-RNA以及ORF7-RNA编码的多肽进行了鉴定。然而，小RNA是否编码蛋白质，又或者它们是否对PCV2的生命周期起一定作用还不得而知。目前认为只有Rep和Rep′是哺乳动物细胞中的PCV2病毒基因组复制所必需的[16-17]。

1.6 病毒遗传物质出核

同Cap一起在遗传物质入核过程中进入细胞核的P32可以作为接合物募集细胞核内蛋白激酶C-δ与Cap，三者进而形成复合物，并一同前往核膜。通过与核纤层蛋白B的结合使得核纤层蛋白 A/C磷酸化，导致核膜重排以促进病毒基因组出核[9]。

2 PCV2跨动物种属感染研究进展

一般认为猪是PCV2的自然宿主，但随着流行病学的深入调查，发现PCV2的感染可能不限于猪还感染反刍动物、啮齿动物、犬科动物、水生动物甚至昆虫等。有研究在患有繁殖障碍的狐狸、貉、貂等动物体内分离扩增出PCV2全基因组，在鼠、蚊蝇以及环境样本、生物制品中检测到了PCV2核酸，甚至在人类血清等样品中也检测到了PCV2。提示PCV2可能存在跨动物种属感染，但PCV2是否能感染非猪源细胞并在其内增殖，甚至对细胞正常代谢或生化反应造成一定影响，还需要开展广泛的流行病学调查和感染机制研究。

2.1 PCV2在非猪动物或其产品中的检测

2.1.1 牛 1999年加拿大研究人员首次在患有呼吸道疾病的牛及流产胎儿的肺组织中检测到了PCV2 基因片段，其扩增产物序列与猪源序列相似度达99%，属PCV2a型，并将其命名为BCV(Bovine circovirus)[18]。2011年美国旧金山超市的牛肉样品中检测出5条PCV2基因序列，其中3条被鉴定为PCV2b型。2年后从旧金山的牛肉样品中再次检测出2组与2011年检测结果相似的PCV2基因序列，此基因序列可能与导致2007年德国犊牛暴发出血性潜在病原体PCV2b(1 767 bp)相同。有研究证实犊牛对PCV2敏感，在人工接种后表现出淋巴结肿大、口腔黏膜和眼结膜潮红以及腹泻的症状。德国科学家在患有牛新生儿全血细胞减少症的犊牛体内发现了2株属于PCV2a和PCV2b基因型的毒株。以上研究数据均支持PCV2存在于牛体内这一假设。从牛上分离的PCV2 都存在氨基酸的点突变位点，表明该位置可能是PCV2的适应性突变，且牛细胞上存在PCV2用于附着于宿主细胞的氨基葡聚糖(GAGs)。对水牛源 PCV2 基因组进行扩增，其全长基因组与猪源全长基因组同源性高达99.77%～99.83%，经鉴定属全球普遍流行的PCV2a、PCV2b和PCV2c基因型，这是我国对非猪源PCV2全基因组序列的首次报道[19]。之后对奶牛、水牛和黄牛的血清和肌肉样本的检测结果显示PCV2只在水牛群中流行，且PCV2毒株在水牛中具有遗传多样性，可分为3种不同的基因型(PCV2b、PCV2d和PCV2e)[20]。另外，水牛源的PCV2基因序列具有特异性的核苷酸取代，但这种特异性是否与PCV2跨物种感染机制有关联还有待考究。

2.1.2 羊 从感染了小反刍兽疫病毒的山羊和健康羊身上分离并扩增出PCV2全基因组[21]。通过对比发现该基因型属于PCV2d，并且与猪源PCV2毒株的同源性高于从其他物种分离的PCV2毒株。对该研究中山羊的肺部和鼻腔样本进行的检测均提示PCV2阳性，这表明在山羊体内亦可能存在PCV2跨动物种属的感染，但是PCV2对山羊的致病性尚未知，且PCV2是否具有在山羊细胞中复制的能力也需通过细胞试验探究。

2.1.3 犬 有研究者从2000年腹泻犬粪便样本中获得的核酸扩增片段(1 768 bp)与PCV2a的DNA序列具有98%相似性，但是PCV2可跨种属感染犬又或仅仅存在于犬的肠道还需通过进一步研究去证明[22]。

2.1.4 人工养殖的经济动物 在患繁殖障碍的养殖狐狸中鉴定出PCV2，对3株狐狸源PCV2毒株进行测序，结果显示这3个毒株均属于PCV2b和PCV2d基因型[23]。流行病学调查结果显示，不孕或有流产症状的病狐PCV2阳性率较高，而健康狐阳性率较低。狐狸源毒株与狐狸养殖场附近猪场分离的PCV2毒株100%相似。PCV2可能是导致狐繁殖障碍的重要病原体之一，提示PCV2极有可能从猪跨种属传播给狐。从病貉分离出PCV2毒株属于PCV2b和PCV2d基因型[24]。貉的流产或不育症状与其PCV2感染显著相关。经基因测序分析，貉源PCV2 毒株与其养殖场周围的猪场分离到的PCV2相似性为100%。貉和狐养殖场流行病学调查结果提示貉和狐都可能因PCV2在其体内感染而患病。从死于腹泻的貂组织样本中分离到PCV毒株，经测序发现其与PCV2密切相关，且与PCV2b基因存在高度相似性[25]。PCV2能否感染貂，其腹泻症状是否由PCV2直接引起需进一步验证。

2.2 人类

目前已在人类粪便和疫苗中检测出PCV2，推测PCV2可能通过食源性途径(食入或接触猪肉产品、食入生牛肉或生奶、饮用生水)、医源性途径(疫苗污染、异种移植感染)、气溶胶传播、生物媒介传播等进入人体内。Rotarix®和RotaTeq®疫苗目前广泛应用于预防婴幼儿轮状病毒感染所致的严重腹泻病，有报道在这些疫苗中检测出了PCV1和PCV2的DNA。另有检测在59个疫苗接种者的粪便拭子样本中的PCV2 DNA 阳性率为28.5%[26]，但其DNA是否在人体内复制尚未清楚。除此之外，多项研究在人血清、消化道样本和呼吸道样本中检测到PCV1或PCV2的特异性抗体。在巴基斯坦儿童粪便样品中PCV1/PCV2阳性率达17%。在溃疡性结肠炎患者的结肠活检标本中也报告了PCV2。甚至有研究报告指出，在感染了PCV2的人类细胞系中发生了病毒蛋白表达、细胞病变效应并且检测到病毒DNA，但该病毒无法传递给新的细胞。

2.3 潜在传播媒介

2.3.1 鼠 小鼠通常作为PCV2感染动物模型，如SPF昆明小鼠、NMRI小鼠、Balb/c小鼠、Black C57小鼠、ICR小鼠等模型。有研究在巴西一猪场中的小白鼠和褐家鼠的脾脏、肺和肾脏中检测到了PCV2核酸。此外，鼠源的PCV2基因组序列与从猪源PCV2基因序列有高度相似性，提示所研究的啮齿动物可能可以被PCV2自然感染。韩国的一项研究也发现，从猪场附近收集的啮齿动物的组织样本中检测到PCV2核酸。有研究对国内部分猪场检测发现31.6%(30/95)的猪场内大鼠PCV2呈阳性[27]。匈牙利的一项研究在感染了PCV2猪场收集了啮齿动物，结果显示PCV2可以同时存在于受感染场所的小鼠和大鼠中(阳性率分别为65.0%和23.8%)，但是在猪场外收集啮齿动物样本PCV2呈阴性，研究者认为啮齿动物需要与猪进行某些接触，没有这种接触，PCV2在啮齿动物中呈阴性。PCV2可能从猪传染给啮齿动物，但其机制尚未清楚。如果没有显著的临床表现，啮齿动物更像是一个PCV病毒携带库和PCV的感染动物模型。以上发现支持猪场的啮齿动物可能会作为生物媒介促进PCV传播的假说。

2.3.2 昆虫 双翅目蝇(家蝇、厩螫蝇)可作为PCV2传播的载体。家蝇可作为PCV2在猪场造成环境污染的衡量指标，从英国某猪场的苍蝇中提取的DNA检测为PCV2b阳性，测序结果显示猪和苍蝇源PCV2b基因型的ORF2序列是相同的。从存在PCV2的繁殖障碍综合征的奥地利某猪场常在蝇类中检测到PCV2呈阳性[28]。推测蝇类可替代血液样本作为PCV2等特定病原体的检测材料。在PCV2感染导致的PMWS病例中，蝇类作为传播媒介发挥着重要作用。此外，库蚊可能作为机械传播载体在猪群PCV2的传播中起作用。但PCV2在昆虫体内建立感染，作为生物媒介传播病毒尚未知。

2.3.3 环境样本 加拿大研究人员在封闭环境的猪场中检测出PCV2的高病毒载量(多达107个基因组/m3)。养猪场和屠宰场的生物气溶胶样本和饲养人员洗鼻液中存在 PCV2，表明PCV2是一种潜在的空气传播病毒[29]。在巴西的不同水样中检测到PCV2，这可能是牛、羊等非猪源动物体内检测到PCV2的重要原因之一。

2.3.4 生物制品 美国食品与药物管理局(FDA)和其他研究机构调查猪瘟病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒疫苗污染源的结果表明，一些细胞系、毒株和疫苗受到PCV1兼或PCV2的污染，而用于细胞培养和疫苗生产的猪源性胃蛋白酶产品是疫苗污染物的主要来源。有研究人员在用于人类的猪源胃蛋白酶产品中检测到PCV2，其完整基因组序列与北美PCV2分离株具有高度相似性。尽管有研究证明污染胃蛋白酶的PCV2是非感染性的，但其依然存在异种移植导致潜在感染的可能性。上述Rotarix®和RotaTeq®疫苗会在人体内脱落PCV2的DNA，可能是导致婴儿粪便拭子PCV2检测呈阳性的原因[26]。

3 展望

非猪源动物PCV2检测呈阳性的主要原因是与猪直接接触或摄入被污染的食物、饮水等。由于PCV2具有广泛的组织嗜性，在猪和野猪的所有组织中几乎都存在PCV2，并且研究发现PCV2b在室温下接种后可存活2 d，在4℃下可存活6 d，在-20℃下可存活30 d，表明了其造成环境污染的可能性之高。环境样本(气溶胶，水体样本等)、生物制品(疫苗、胃蛋白酶产品)以及鼠和昆虫均可作为媒介传播PCV2，但其他种属动物能否通过这些途径自然感染PCV2还需进一步研究证明。此外，在非猪粪便样本中可以经常检测到PCV的存在[30]。这些现象均为PCV2可能存在的跨动物种属感染提供了条件。而在人群血清、肠道、呼吸道中检测到PCV2的特异性抗体，除过进一步表明PCV2存在跨动物种属感染的可能，还提示了一种新型人兽共患病的隐患。综合PCV2的基因复制机制与已报道的PCV2检测阳性案例，笔者合理推测PCV2存在跨动物种属感染的潜能(从猪到反刍动物、啮齿动物、犬科动物等)。目前对于PCV2的治疗与防控策略仅停留在疫苗预防阶段，大多使用传统疫苗(猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体二联灭活疫苗等)免疫，成本高且费时费力。而对于PCV2跨动物种属感染机制的研究，不仅可以在分子生物学水平对该病原体进行深入了解，同时也为潜在的新型抗原受体阻断药物研发提供重要的基础资料，是将科学研究转化为临床生产力的一个可能途径。为在后非洲猪瘟时代给兽医公共卫生领域提供创新的预防策略、减小PCV2对养殖业的危害，同时也为保障人类公共卫生安全，笔者认为对于PCV2的感染机制及其跨动物种属感染可能性的深入研究具有重要意义。