2020 国际肝移植协会（ILTS）肝脏机械灌注共识<br/>——专家解读

2020 国际肝移植协会（ILTS）肝脏机械灌注共识
——专家解读

2022-11-26于欣雨郭志勇中山大学附属第一医院器官移植科广东广州510080

实用器官移植电子杂志 2022年3期

于欣雨，郭志勇（中山大学附属第一医院器官移植科，广东广州 510080 ）

在过去20 年里，机械灌注（machine perfusion，MP）一直是肝移植中最重要的研究方向之一，并于10 年前进入临床试验阶段。迄今为止，关于机械灌注发表的临床试验很少，其对比常规冷保存（static cold storage， SCS）的优势尚未完全确定。

本文介绍了国际肝移植协会（International Liver Transplantation Society，ILTS）在 2020 年ILTS “心脏死亡供体（cardiac death donor，DCD）、肝脏保存和机器灌注”共识会议中总结的专家共识。会议邀请了36 位DCD 肝脏移植和机械灌注领域的专家，共识最终版本得到所有作者同意。

围绕肝脏机械灌注的临床试验设计，主要讨论了以下4 个问题：① 未来随机、对照研究（randomized controlled trial，RCT）应比较哪些器官保存技术。② 如何设定临床相关的研究终点。③ 未来应研究的移植物种类。④ 临床试验最新进展。

1 肝脏机械灌注临床试验设计面临的挑战

1.1 统计效能和主要终点：在临床RCT 设计中，主要终点的确立非常重要，可以影响临床试验结果［1-10］。通常情况下，RCT 只需要一个主要终点，并且建议在RCT 设计时就要对其进行定义［11-12］，并基于主要终点进行样本量计算。

传统的主要终点（例如1 年移植物丢失率、患者生存率等）需要大量的样本量才可以达到其统计功效，是目前面临的主要问题［1-6］。

解决方法之一是将研究对象设定为高风险移植物［13-14］。在机械灌注安全性得到保障的情况下，可以尝试利用扩大标准供肝来进行临床试验。相较于标准供肝，扩大标准供肝有较高的并发症发生率、移植物丢失率、移植肝原发性无功能（primary renal graft nonfunction，PNF）发生率等，要达到统计学差异，所需的样本量会减少。但此方法也存在问题。首先是扩大标准供肝的定义不明确；其次由于纳排标准不同，受体的选择并不随机［14］，因此临床试验结果不具有较高代表性。据统计，现有RCT 中，只有53%样本量计算合理［15］。

推荐意见1：建议在RCT 设计时就对主要终点进行定义并基于主要指标进行样本量计算。

推荐意见2：在保障机械灌注安全性前提下，将研究对象设定为高风险移植物可以减少样本量，达到主要终点的统计功效，但此类临床试验结果不具有较高代表性。

推荐意见3：建议首先明确扩大标准供肝的定义，保障不同RCT 研究对象的一致性。

1.2 替代指标（实验室生物标志物）：替代终点的定义为一种有效、能快速评估、发生率高的生物标志物，并且与传统主要指标有很强的关联性［5］。其局限性在于，替代终点可能不能有效地预测最重要的临床指标［1，5］。

目前有很多正在使用的评估肝脏活力和损伤的替代标志物，但它们是否是长期移植预后的充分预测指标，仍缺乏确切证据［16-17］。理想的生物标志物应该具有特异性、易于检测、价格低廉且能快速评定，且能准确预测长期临床试验结果。但目前机器灌注临床试验中，没有能达到此标准的替代指标［16-18］。

推荐意见1：替代终点比传统终点更易达到，但可能不能有效的预测最重要的临床指标。

推荐意见2：虽然目前有很多在用的评估肝脏活力和损伤的替代标志物，暂不推荐临床试验中使用未经多中心前瞻性临床研究证实的替代终点来预测长期移植预后。

1.3 复合终点：随着医疗技术的进步，并发症等不良事件发生率降低，因此临床试验需要更大样本量来评估新技术的安全性和疗效。为提高结局指标统计效能和临床试验效率，可使用复合终点。复合终点通常包括不良事件、患者死亡和移植物缺失等，例如目前使用的“综合并发症指数（the comprehensive complication index，CCI）”或“术后早期移植物功能不全（early allograft dysfunction，EAD）”等。但应注意，使用复合终点前需假设个体数据具有等效性，需报告复合终点中所有组成指标的结果，但最后只需总结复合终点意义即可。

推荐意见1：外科和移植领域试验可使用CCI评分作为主要终点，机器灌注试验可使用EAD 得分作复合终点。

推荐意见2：使用复合终点时应注意记录样本差异性，对于复合终点中包含的各项指标，应详细描述。

2 结果

临床试验总结：共识针对以下几个问题做出解答。

与SCS 相比，机械灌注保存效果更佳：目前已发表的两篇关于常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）的RCT［19］，显示其效果较SCS 更好。关于低温机械灌注（hypothermia mechanical perfusion， HMP）的RCT 结果未发表，故无法准确得出结论。

如何设定临床相关的研究终点：共识推荐使用直接临床指标（例如1 年移植物生存率、1 年患者生存率、ITBL/胆道并发症发生率、住院时间、住院时间（intensive care unit，ICU）、急性肾损伤、总并发症发生率、等待名单上患者病死率、器官利用率、总费用）作为主要终点。并建议建立包含所有肝脏机械灌注病例的国际登记系统、多中心研究，寻找新型可靠的生物标志物。

未来RCT 中应比较哪些器官保存技术：共识认为应优先将新的灌注技术和SCS 进行比较。已发表的试验大多为安全性试验（Ⅰ期）或非随机性试验（Ⅱ期）。建议RCT 对NMP 与 HMP、常温区域灌注（normothermic regional perfusion，NRP）进行比较，充分考虑多种变量组合，着重注意试验的主要终点和次要终点，同时关注卫生、经济和后勤问题。

未来应研究哪些移植物？以往很多初步研究都纳入标准供肝，来评估机械灌注的可行性与安全性。在此基础上，指南建议未来临床试验可将重点放在扩大标准供肝上（DCD、老年肝、脂肪肝等）。但高风险器官的灌注对经济和后勤要求较高［14，20］，很大程度上会限制器官利用率的提高。并且，扩大标准供肝的定义至今仍不清晰，还需进一步确立。

3 讨论

3.1 机械灌注相关参数描述缺乏标准化：肝脏机械灌注的临床试验数量在近15 年显著增长。目前存在几种不同的机械灌注方法，它们在温度设置、是否氧合、灌注流量或压力有所不同。因此清楚地描述以下参数设置是很重要的：灌注流量/压力/阻力，移植物重量〔如ml/（min·100 g）〕、灌注液温度、双测血流/单测血流供应、氧饱和度和分压、灌注液组成以及补充治疗药物等。除此之外，对于如何报告心死亡供肝（DCD）数据也缺乏标准化。

指南建议采用统一的命名［21］加强临床试验之间标本的比较分析（灌注液、血液、胆汁和组织等）。

推荐意见1：目前机械灌注文章中用于描述不同机械灌注技术的命名法（包括缩写）、温度认定（低温/常温）以及灌注方法的细节描述等缺乏标准化。

3.2 样本量和成本：移植临床试验一般需要大量样本才能达到统计学差异［2，6］。目前肝脏机械灌注临床试验受限于样本量过小。单中心、单臂研究虽然有助于提供初步临床结果，但如果要评估机械灌注的有效性，则需多中心随机对照试验。

针对回顾性研究可能出现的选择偏倚等问题，建议建立机械灌注供肝的国际或国家数据登记中心［22］，通过人工智能或合理的分析方法，对数据进行回顾性研究，获得新型生物标志物，有可能辅助我们不断更新供肝质量评估方法。

未来机械灌注的广泛使用不仅取决于临床试验结果，也与耗费成本有关［20］。机械灌注通常耗资巨大，需要额外的灌注团队成员进行肝脏灌注。供受体医院间机器运输和人员往返也相当复杂［14］。

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为解决耗资问题，肝脏机械灌注的试验设计必须重新调整，以确保试验成本降低。据此，共识建议进行主方案设计。主方案设计可同时进行多个子研究，来验证多个假设，提供更有效的结果和试验评估方法。但目前主方案设计仅在肿瘤研究中进行［23］。

推荐意见1：机械灌注临床试验与医疗行业可能产生利益冲突，需要加大试验透明度，并确保独立监督和数据分析。

3.3 对照组的正确选择：临床试验中，对照组的选择十分重要，会影响RCT 的效能。在大多数情况下，对照组应该选取标准治疗手段。标准治疗手段可以是国家批准的方案，共识指出的“最常见治疗手段”或在特定中心使用的标准方案［1，24］。在机械灌注临床试验中，对照组通常使用UW 或HTK 保存液的常规冷保存技术（static cold storage，SCS）。但目前移植界越来越关注不同机械灌注技术之间的比较。与肺、肾不同，肝脏无法配对进行试验，存在供体和受体的混杂变量，因此可能需要试验对象分层（如根据DBD/DCD 状态、年龄、脂肪变性程度等）。但研究对象分层的结果往往需要更大样本量。

3.4 机械灌注试验盲法实施困难：在开展肝脏机械灌注临床试验时，盲法较难实施。因为机械灌注插管和供体准备通常由同一团队进行，而机械灌注通常与肝移植手术在同一手术室进行［25］；且灌注操作复杂，移植中心人员紧张，因此需要负责移植手术的外科医生也进行器官修整、插管和启动等机械灌注工作。因此很难确保临床研究盲法的实施。

临床试验的终点评估应尽可能基于客观数据，避免存在主观判断。例如，外科医生对器官灌注质量评估比较主观，因此是一个较差的终点；而麻醉师基于对血压的测量来评估复流后综合征，可能比较客观，因此是一个更好的终点。

推荐意见1：在肝脏机械灌注的临床试验中，盲法很难保障，降低了临床试验的科学性与随机性。临床试验的终点评估应尽可能基于客观指标，避免主观判断。

3.5 机械灌注缺乏可靠生物标志物和其冲洗效应：目前，还缺乏可靠的生物标志物预测肝移植的临床结果。大多数研究使用移植后血清转氨酶或早期移植物功能不全（early allograft dysfunction，EAD）［26］评估肝脏保存质量［16-17，27］；同时也使用EAD 或转氨酶峰值作为其主要终点［28］。这些指标一直在常规冷保存技术中被使用，但目前未在机械灌注中得到确认［29-30］。

肝脏活力判定方法通常采用灌注液转氨酶、乳酸清除率和胆汁生成三者结合［18，28，31-32］。其中转氨酶水平可能受供体年龄、脂肪变性、缺血时间等因素的影响。因此，共识建议灌注液转氨酶应针对肝脏重量和灌注液量进行调整，达到标准化，以便与其他灌注系统和不同肝脏进行比较。

指南认为，在机械灌注临床试验中，转氨酶峰值和EAD 不是首选的主要终点，原因如下：① 急性肝炎转氨酶水平：在缺血性和中毒性肝损伤坏死和恢复都会出现转氨酶水平迅速下降［33］。且在急性自身免疫性肝炎的情况下，血清转氨酶水平与生存率无关［34］；② 非移植肝切除手术后转氨酶水平：术后转氨酶峰值与肝门阻断时间或术后并发症无关［35］；③ 供肝转氨酶水平：多项回顾性研究表明，供体转氨酶与移植物生存率无显著关联，不是移植物生存率的理想预测指标［36-42］。④ 受体移植后转氨酶水平：多项研究表明，天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）峰值与PNF、1 年移植物存活率、移植物废弃率等显著相关［29-30，43］，可被用作肝脏保存研究的替代终点。然而，也有研究认为转氨酶水平与保存过程中器官损伤评判没有关系［44］。功能良好的移植后肝脏早期AST 水平也可高达17 600U/L［45］。⑤ 转氨酶的稀释和洗脱：术后转氨酶水平可能受肝脏大小、机械灌注过程和灌注液量的影响（冲洗效应）［13-14，22，25］。大多数研究没有根据肝脏大小调整转氨酶值。机械灌注的器官用大量保存液冲洗，或再灌注和充氧，移植物中积累的转氨酶释放到灌注液中，并没有在移植后立即释放到受体中，导致器官植入时供肝中的代谢物和生物标志物，如细胞因子、AST 和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等浓度不同。因为转氨酶的半衰期很长〔AST ：（17±5） h，ALT：（47±10） h〕［33，46］，所以接受没有进行机械灌注供肝的受体移植后转氨酶水平通常较高，而接受机械灌注移植物的受体水平较低［13-14，22］。

对于可用作肝移植预后预测指标的参数知之甚少，目前提出了几种移植后早期测试和评分（复合终点）［47］。最常用的为EAD 标准，是一个二分类变量，指的是移植7 d 内转氨酶峰值（AST 或 ALT ＞2 000 U/L）、第7 天胆红素≥10 mg/dl 或者INR ≥1.6。MEAF 评分是连续变量，选择上述指标前3 d 最大值，并进行评分。现已证明MEAF 比EAD 评估更可靠［48-50］。在机械灌注中，EAD 的作用可能有所下降。因为大量灌注液冲洗或在常温下复氧后，转氨酶会被动或主动释放到灌注液中，转氨酶峰值会降低。通常情况下，转氨酶峰值会发生在移植后的前24 h，也会影响EAD 发生率［51-52］。在一项大型随机研究中发现MP 和SCS 之间的 EAD 发生率差异主要取决于转氨酶值［53］。建议不应将转氨酶峰值和与其相关的EAD 作为机械灌注试验的主要终点［13-14，25，54］。因此，EAD 可能需要重新定义。最近有研究尝试添加血小板计数或V 因子作为EAD的生物标志物［55-56］，新的EAD 计算公式同时包含了肝脏合成功能和损伤标志物，可能会解决上述问题。目前新提出的参数 L-GrAFT 风险评分高度准确，可以预测移植后3 个月的移植失败，比现有的EAD和 MEAF 评分更准确［55，57］。

3.6 机器灌注期间活力测定：机械灌注时可以对移植肝脏进行活力检测。主要检测内容包括肝脏外观、水流/血液动力学、代谢和排泄功能等。 NMP使器官最接近生理状态，因此最常用于评估肝脏活力。低温机器灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）由于肝脏代谢显著降低，胆汁产生量极少，实施活力测定具有挑战性。目前，肝脏活力测定并没有确定，主要聚焦在灌注液乳酸清除率、灌注液pH 值维持、葡萄糖代谢维持、胆汁产生（NMP 情况下）、胆汁pH 值等参数［58-63］。对于低温有氧机械灌注（hypothermic oxygenated perfusion，HOPE），黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）是目前提出的唯一损伤标志物［61］。截止目前，有一些指标报道较有效，但都缺乏随机临床试验进行验证。未来希望通过人工智能/机器学习，对灌注和移植后获得的所有生物标志物进行分析，创建更可靠的肝脏活力测定。

3.7 选择性偏差、随机化：在机械灌注临床试验中，认识到选择性偏差是很重要的。RCT 中常见的导致选择性偏差的原因有分配过程设计不佳、盲法缺失或不完整等。

MP 随机化时间取决于研究目的。例如，如果主要目的是比较不同方法的保存效果和移植后结果，则随机化时间应在外科医生进行移植评估和肝活检之后。在这之前进行随机化可能会导致选择偏倚。目前，没有明确的肝脏活力测定指标，肝脏移植或丢弃通常取决于移植中心本身的主观判断［64］。如果研究目的是评估器官利用率，则应尽早进行随机化，最好是在器官分配时，甚至是将患者列入移植名单时。指南还建议详细描述每个研究组中丢弃的所有移植物（灌注之前或之后）或任何设备故障，避免器官选择偏倚。

3.8 移植物重新分配：共识建议移植中心和器官获取组织制定一项应急措施，针对移植物被移植中心拒绝或受体不适宜移植的情况，快速重新分配供体器官。当已同意试验受体在移植前或术中血流动力学不稳定（如术中发现晚期癌症）而导致不再符合条件时，或置于灌注机上的供肝由于灌注过程中性能差而被拒绝时，根据器官分配规则应将分配给匹配列表上的下一位受体（并非一定分配给纳入此临床试验的受体）。如果使用仍在实验阶段的技术（尚未经监管机构批准），受体应签署知情同意书，并得到机构审查委员会的伦理批准。进行临床试验的中心应提前与其他中心沟通重分配问题，避免供肝分配延误［22］，同时应该讨论供肝在到达下一中心时，继续进行灌注还是变为常规冷保存技术。

推荐意见1：当受体中心拒绝使用移植物或预期受体不再适合移植物时，重新分配灌注肝移植物，可以避免在灌注肝脏不能使用时分配延迟或移植物废弃。

4 结论

机械灌注是肝移植中非常有发展前景的技术［65-69］。在过去10 年中，很多肝机械灌注的临床试验设计存在局限性［13，28］。大多数机械灌注临床试验的功效不足，有些没有具有临床意义的主要终点。随着我们从早期探索进入成熟阶段，肝脏机械灌注临床试验设计应该更加标准化，数据输出应更有质量，有助于保障患者健康并推动领域发展。