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间充质干细胞在肾脏机械灌注中应用进展

2022-11-26莫舒咏张鹏王彦峰武汉大学中南医院武汉大学肝胆疾病研究院武汉大学移植医学中心移植医学技术湖北省重点实验室湖北武汉430071

实用器官移植电子杂志 2022年3期
关键词:免疫调节移植物充质

莫舒咏,张鹏,王彦峰(武汉大学中南医院,武汉大学肝胆疾病研究院,武汉大学移植医学中心,移植医学技术湖北省重点实验室,湖北 武汉 430071)

器官移植已经成为终末期器官衰竭的一线治疗,尤其是肾移植已成为一种常规治疗手段,在世界范围内得到大力推广。为了缓解器官短缺,越来越多的边缘供体(expanded criteria donors, ECD)器官和心脏死亡供体(donation after cardiac death,DCD)器官应用于临床。然而,与标准供者相比,来自ECD 和DCD 的器官更容易发生缺血/再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI),导致发生原发性移植物无功能 (primary graft nonfunction, PNF)和移植物功能延迟恢复 (delayed graft function, DGF)的风险增高[1]。在过去的几十年中,静态冷保存(static cold storage,SCS)一直是最主要的器官保存方式,随着ECD 和DCD 器官的大量应用,低温机械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)被广泛应用,并已证实HMP 对改善ECD 供肾移植预后具有一定意义。此外,常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP)可在接近生理的条件下维护器官,成为了器官保存新的研究方向,不仅提供了延长保存时间的可行性,实现对器官功能的评估,还为器官体外治疗开辟了全新的视角。研究表明NMP 技术本身便可通过抑制炎症减少IRI 的发生[2],此外,在灌注液中添加药物或具有治疗作用的细胞可能有助于诱导器官修复和再生。间充质干细胞/间充质基质细胞(mesenchymal stem/stromal cells, MSCs) 具有广泛的抗炎和免疫调节作用,既可以通过旁分泌趋化因子、细胞因子和生长因子等物质发挥抗炎作用[3],还能通过抑制T 和B 细胞增殖、抑制树突状细胞成熟进行免疫调节[4],MSCs 已成为实体器官移植的治疗性细胞群。本文综述了肾移植机械灌注的现状,并强调了这一技术与MSCs 有机结合在器官修复中的治疗潜力。

1 器官保存:从低温静态保存到机械灌注

SCS 目前仍是移植前器官保存的标准手段[5]。低温可抑制酶的活性,有助于减缓三磷酸腺 苷(adenosine triphosphate,ATP) 的 消 耗, 并允许器官在缺氧的情况下较长时间储存[6]。然而,缺氧环境也可导致器官损伤[7]。随着ATP的耗尽,包括腺苷、肌苷和次黄嘌呤等细胞内的有毒物质会逐渐积累。无氧代谢将降低细胞内pH 值,导致溶酶体激活,造成细胞损伤。Na+/K+ATP 酶的失活诱发细胞内钙、钠和水的潴留,导致细胞水肿。且随着器官缺口越来越大,来自ECD 和DCD 的器官被大量使用,这些类型的肾脏IRI 更重, DGF 发生风险更高。因此,机器灌注 (machine perfusion,MP) 技术重新进入了人们的眼球。研究发现HMP 明显优于SCS,尤其是应用在ECD 肾脏中。HMP 减少了DGF 的发生,且更好地恢复移植物功能,显著提高了移植物的长期存活率[8-10]。然而,即使用HMP 保存DCD 肾脏,长冷缺血时间(cold ischemia time,CIT)仍然是DGF 独立和相关的危险因素之一[11]。而且,在低温条件下难以客观评估器官质量,修复器官损伤的手段也难以实施。NMP 是一种在体外模拟生理条件并保持器官全部代谢功能的灌注系统[12]。对于低温耐受性差的ECD 器官,NMP 可能是器官体外保存的理想选择,它不仅可以恢复有氧代谢,让肾脏恢复功能,最大限度地规避冷缺血性损伤。其次,它可作为一种评估手段,依据肾脏大体观、肾血流量和总尿量等指标对供肾的功能状态进行评估[13]。最后,它可以在移植术前对器官进行多手段的靶向性治疗,为治疗IRI、降低排斥反应以及延长移植物存活方面提供了巨大的空间。

2 MSCs 的潜能

“MSCs”在文献中通常指两个不同的词:间充质干细胞(mesenchymal stem cells)或间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells) 。这两个词有不同的命名和定义。前者是中胚层来源的多潜能基质细胞,具有高度的自我更新和多向分化潜能,具有免疫调节和炎症归巢能力,以及修复受损组织器官的能力。后者是指从组织的间质-血管部分去除造血细胞和内皮细胞后得到的异质细胞混合物[14],包括多能间充质基质细胞、多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCs)和分化的成熟细胞。国际细胞治疗学会(International Society of Cell Therapy,ISCT)制定了鉴定间充质基质细胞的标准:① 在标准培养条件下可贴壁;② CD105、CD73 和CD90 阳性,CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a 或CD19 和HLADR 表 面 分 子 阴性;③ 体外分化为中胚层细胞:成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞[15]。与间充质干细胞一样,多能间充质基质细胞具有自我更新和多向分化的能力[16]。

MSCs 在肾脏器官移植中的作用已有研究。MSCs 的抗炎特性、修复受损组织能力和免疫调节功能使其成为肾脏再生治疗的理想干预手段,这意味着应用MSCs 有可能降低IRI[17]和急性排斥反应的发生率,促进免疫抑制甚至建立移植耐受[18]。理论上,MSCs 的修复能力来自于其向外胚层和内胚层细胞分化的潜能,通过再生分化取代受损和坏死的组织。然而,越来越多的证据表明,MSCs 的疗效主要依赖于其旁分泌效应,而不是它们本身的再生作用[19]。据报道,损伤组织中趋化因子或其受体的过表达可促进MSCs 的增殖和迁移[20],MSCs募集后再通过旁分泌生物活性因子,包括趋化因子、细胞因子和生长因子等,来刺激附近的细胞进行组织修复,发挥其抗凋亡、抗炎、抗纤维化和血管生成的作用。有研究表明,应用MSCs 后,受损心脏中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGF)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)水平显著升高,与对照组相比有更好的再生效果[21]。此外,MSCs 的免疫调节特性主要与细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10 (interleukin-10,IL-10)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)有关,可通过产生细胞因子如IDO、PGE2、TGF-β、HLA-G5 和NO, 利 用CXCL9 和CXCL10 影响邻近细胞的免疫调节[22]。MSCs 对免疫系统的激活和成熟都有抑制作用,可以促进免疫细胞分化为调节或抑制表型[23]。

目前已有一些临床试验研究了以肾移植受者为对象的MSCs 疗法的安全性和效果。这些研究证明通过静脉输注给予MSCs 对移植物或患者存活率没有不良影响,没有出现与MSCs 输注直接相关的毒性,感染或肿瘤的易感性均无增加[24-26]。研究表明MSCs 在许多肾脏疾病包括急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)、慢性肾病(chronic nephrosis,CKD)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、动脉粥样硬化性肾血管疾病和肾移植可发挥有利作用[27]。然而这些试验在研究设计上存在巨大的异质性,还有许多悬而未决的问题如MSCs 的来源、输注剂量、最佳给药时机和频率及辅助的免疫抑制方案仍有待确定。此外,MSCs 在体内的定位和存留问题也存在争议[28]。由于体外培养的MSCs 直径超过20 μm,远大于循环中的免疫细胞,也大于肺毛细血管的管径,大部分MSCs 在静脉输注后滞留于肺部。同时,通过其他途径给药也会导致MSCs 滞留在其他器官中,如通过门静脉给药的MSCs 可在肝脏中被发现,在肌肉、脊柱和脂肪垫等组织内给药的MSCs 可在局部停留长达数周的时间。此外,MSCs 本身寿命较短,尤其是移植后体内微环境恶劣,存活的MSCs数量较少[29]。由于存在致命性肺栓塞的风险,通过加大注射浓度来提高MSCs 存活量并不可行。

近年来,诸多研究表明MSCs 通过其旁分泌产生的外泌体发挥治疗效果。外泌体(exosomes,EVs)是一种由细胞分泌的纳米级脂质双层结构颗粒,直径为50 ~ 200 nm。它可来自于全身各种类型的细胞,并大量存在于体液中,通过转移生物活性分子(如蛋白质、核酸和脂质)参与细胞间的通讯[30]。与可溶性细胞因子不同,外泌体的包裹能力赋予了内部分子高度的稳定性,保护它们免受酶的降解,并介导它们进入受体细胞发挥作用[31]。值得注意的是,MSCs 是生产外泌体最高效的细胞类型之一[32],因此外泌体作为基于MSCs 的疗法很有前景,优势在于外泌体的免疫原性较低,具有跨越组织和细胞屏障的能力,并对损伤部位具有趋向性。

3 机械灌注与MSCs 的联合疗法

机器灌注提供了一个独特的平台,可选择性地将MSCs 或外泌体直接注入供体器官,从而克服归巢、滞留和安全性问题。为了验证在机械灌注中应用MSCs 是否可行和灌注条件对MSCs 的影响,Parraga 等[33]分别使用灌注液和细胞培养液对新鲜和冻融的人(h)MSCs 和猪(p)MSCs 进行培养,结果证明灌注液对两种MSCs 的存活、增殖和分泌能力均无明显影响,而MSCs 的冷冻-解冻过程、悬浮而非贴壁的培养状态对其存活和功能的影响更大。悬浮条件下培养的hMSCs 在灌注液中的存活率降低15%,pMSCs 在灌注液和培养液中的存活率均降低40%。冻融过程使hMSCs 存活率降低25%,且可观察到冻融后的pMSCs 与猪主动脉内皮细胞(porcine arotic endothelial cell,PAOEC)和hMSCs 与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的黏附明显减少,细胞内ROS 表达水平增高。这说明冻融过程可能通过ROS 高表达增加氧化应激,进而对线粒体造成损害,使MSCs 对内皮细胞的黏附能力降低。

Brasile 等[34]应用无细胞的灌注系统——失血代谢支持技术评估了MSCs 疗法对DCD 供肾IRI 修复的潜力。EMS 系统包括无细胞培养基、灌注系统、生物传感器、一次性器官腔以及中心控制模块[35]。在32℃下5对DCD供肾经EMS系统灌注24 h,其中实验组灌注1×108MSCs。结果证明在体外24 h热灌注加入MSCs 干预有可能实现缺血损伤的肾组织再生,包括ATP 和生长因子的合成增加,炎症反应减轻,细胞骨架修复和有丝分裂增强。

Pool 等[36]评估了在NMP 过程中灌注液内MSCs 的定位和去向。猪肾在常温下机械灌注7 h,在NMP 1 h 后分别加入0、105、106或107荧光标记的人脂肪组织来源的MSCs,灌注结束后只有在107组的肾小球毛细血管管腔内可检测到完整的MSCs。这说明NMP 联合适量MSCs 治疗供体肾脏是可行的。此外,在NMP 期间灌注液中的MSCs 数量随着时间的推移迅速减少,这可能与细胞迁移到移植物中、非生理的悬浮条件致细胞死亡以及灌流系统循环产生的压力和流体力学有关。

随后,该团队[37]研究了NMP 联合MSCs 是否对肾功能有影响,以及分泌何种细胞因子。在活体猪肾脏热缺血20 min 后进行HMP 2 ~ 3 h,随后进行总时长7 h 的NMP,在NMP 1 h 时分别加入107人脂肪来源(A)-MSCs 和107骨髓来源(BM)-MSCs。结果发现与对照组相比,MSCs 灌注的肾脏乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白水平降低,而人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、IL-6 和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)水平升高。这提示MSCs 在NMP 过程中作用于受损肾脏,可降低损伤标志物水平,并诱导免疫调节细胞因子的释放。但该研究未进行移植研究,无法确定这些影响是否与受损肾脏的短期和长期移植物功能以及存活率有关。

Lohmann 等[38]使用猪自体移植模型评估了NMP 期间使用MSCs 治疗肾脏的安全性和可行性,并观察移植后14 d 内MSCs 治疗对肾脏的潜在改善作用。该研究证明,热灌注后MSCs 仍保留在肾小球内,而移植后第14 天MSCs 的在肾数量衰减20 倍。研究者认为MSCs 潜在的益处并不一定取决于它们的长期存活率,因为MSCs 和宿主细胞之间的相互作用可能会启动免疫调节和再生过程,这些过程在MSCs 消失后仍在继续。然而,研究并未发现MSCs 诱导免疫调节反应的证据,移植后功能、早期纤维化标志物和组织学均无改善。在NMP 期间加入MSCs 是安全的,并且不会对灌注动力学或移植物存活率造成明显的改变。

MAPCs 是一种成人骨髓来源的间充质基质细胞。它们缺乏主要组织相容性复合体MHC-Ⅱ或共刺激分子(CD80、CD86 和CD40),并且MHC-Ⅰ低表达,对T 细胞增殖和细胞因子产生具有非免疫原性[39]。MAPCs 细胞通过释放抗炎和免疫调节的细胞因子,限制致病性免疫细胞的浸润和增殖。Thompson 等[40]研 究 了MAPCs 细 胞 在 肾 脏NMP 中的治疗潜力。来自同一供体的人肾同时灌注7 h,NMP 1 h 后治疗组肾脏接受50×106MAPCs。经MAPC 治疗的肾脏表现为尿量增加,损伤生物标记物NGAL 表达减少,微血管灌注改善。免疫荧光显示NMP 时肾脏血管周围间隙有预标记的MAPC 细胞。这是首次在体外灌注平台上成功地将细胞直接输送到人类供体肾脏,且证明NMP 联合MAPC 细胞治疗肾脏可使其功能得到改善,降低损伤和减轻炎症。

Gregorini 等[41]用 含 有MSCs 或MSCs 分 泌 的EVs 的灌注液低温(4℃)灌注大鼠肾脏4 h。这两种治疗均显著减少了肾脏的组织学病变,整体肾损伤评分总体降低。结果显示负责分子转运、柠檬酸循环、呼吸链电子转运和抗氧化活性的基因集和单个基因显著上调。此外,灌注液生化分析提示缺血标志物如乳酸和LDH、氧化应激标志物丙二醛水平显著下降,丙酮酸增加,葡萄糖降低,表明HMP期间肾脏代谢能力增强。重要的是,与MSCs 灌注的肾脏相比,EVs 组的治疗效果更为显著。这表明在短时间的体外灌注过程中,直接地输送游离的EVs 是可行的,甚至效益更高。

4 展 望

目前,体外机械灌注为器官保存、治疗和再生打开了全新的视角,为ECD 和DCD 器官的治疗和修复带来了希望。基于机械灌注这一体外治疗平台和MSCs 的现有研究,将两者联合有助于实现ECD和DCD 器官的高效使用。然而,目前关于MSCs 在体外机械灌注中应用的研究报道较少,主要集中在其可行性和安全性方面,还没有确凿的证据证明其临床有效性。因此,未来的研究应聚焦于MSCs 及EVs 在机械灌注中的作用效果和机制,进一步优化其应用条件,从而提高ECD 和DCD 器官移植的成功率。

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