机械灌注在肾移植中的应用进展

2022-11-26陈旭春程颖中国医科大学附属第一医院器官移植科辽宁沈阳110001

实用器官移植电子杂志 2022年3期

陈旭春，程颖（中国医科大学附属第一医院器官移植科，辽宁沈阳 110001）

由于移植肾器官短缺，尸体供肾的评估及有效合理应用非常重要。机械灌注（machine perfusion，MP）可能通过降低移植肾功能延迟（delayed graft function，DGF）的发生率和改善移植肾的预后，从而增加供肾的使用和改善移植结局。机械灌注方法有低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）、低温氧合机械灌注（hypothermic oxygenated machine perfusion，HOPE）、亚常温机器灌注（subnormothermic machine perfusion， SMP）和常温氧合机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）等方法［1-2］。本综述旨在描述机器灌注的历史、常用类型、相对于静态冷保存（static cold storage，SCS）的优势、实际问题、当前使用和未来前景。

1 机械灌注的历史

1849 年，Loebell［3］首次通过猪肾的血管对肾脏上进行了体外灌注，注入了抗凝血液，观察到尿液形成。20 世纪30 年代，Carrel 等［4］设计了第一台使用人工营养介质的灌注设备，并提出器官可以储存在封闭系统中。然而，用于移植的体外灌注器官保存技术难度大，成本高昂，很快就不受欢迎。20 世纪50 年代末，Schloerb 等［5］描述，如果将器官储存在低温介质中，器官可以保存更长的时间。1962 年，Humphries 等［6］应用低温保存血浆在脉冲灌注泵中对犬的肾脏进行机械灌注，灌注24 h 后成功地进行了犬自体肾移植。随后Collins等［7］使用晶体溶液代替血浆，也获得了动物试验的成功。1967 年，Belzer 等［8］在器官移植的机器灌注方面取得了实际可行的突破。但是由于静态冷保存的简单性、经济可行性以及机器灌注效果的不确定性，因此静态冷保存在半个世纪的时间内仍然是主要的保存技术［9］。然而过去的10 ～15 年内，机械灌注重新引起了人们的兴趣，并且获得了很多积极的结果［10］。

2 低温机械灌注

HMP 是目前用于肾脏保存的最常用的机器灌注类型。在HMP 中，灌注液是无细胞胶体液，灌注温度控制在1 ～ 8℃。无论是静态冷保存还是HMP，都是通过降低器官代谢率和氧需求来延长器官的保存时限。HMP 的其他益处包括含灌注液的活跃循环、清除代谢产物和器官内血流动力学的改善，以及其他潜在机制比如内皮保护作用。

有很多关于静态冷保存与HMP 对移植物功能影响的对比研究。HMP 有助于立即改善肾脏微循环，这种作用可能是通过保护内皮细胞抵抗缺血/再灌注损伤和减少凋亡［11］。有很多研究证明HMP 显著降低了DGF 的发生率和持续时间。在最近发表的一项涉及14 项临床试验的荟萃分析中［12］，与SCS（来自14 项研究的2138 例参与者，RR ＝0.77；0.67 ～ 0.90，P ＝0.0006）相比，HMP 降低了所有类型供肾的DGF 风险，包括脑死亡后捐赠（donation after brain death，DBD）和心脏死亡捐献（donation after cardiac death，DCD）。在另一项荟萃分析中也发现了类似的结果［13］，包括7 项随机对照试验和11 项非随机对照试验。

Moers 等［14］在欧洲进行的随机对照研究也显示在HMP 组内DGF 的发生率和持续时间减少，与所用肾脏类型（DCD、DBD、SCD 或DCD）没有区别，这项研究被称为HMP 和SCS 对比的里程碑式研究。在亚组分析中，在HMP 组中，冷缺血时间延长被发现是DGF 的独立危险因素，在冷缺血时间短的组内，DGF 的发生率最低。

HMP 在保护肾脏方面的长期效果仍然存在争议，争议的焦点在于HMP 应用引起的DGF 减少是否会转化为移植物和患者存活率的提高。有荟萃研究显示HMP 对原发性无功能、急性排斥反应、移植物或患者长期生存率没有明确的益处，尽管DGF发生率显著降低［15］。在最近的1 项随机对照试验中［16］，80 对DBD 肾脏随机分为HMP 组和SCS 组，HMP 组的DGF 发病率较低。但急性排斥反应、原发性无功能、移植物丢失或患者死亡的发生率并没有差异。有研究表明HMP 可安全延长DBD 供肾的冷缺血时间［17］。2009 年的欧洲移植RCT 确实显示HMP 在移植术后1 年GFR 和减少移植失败方面优于SCS。然而，PNF 和1 年患者生存率没有差异［12］。他们对同一队列的3 年随访显示，机器灌注组的整体移植物存活率更高，对DBD 肾的影响更大，但对DCD 肾的影响不明显，对ECD 肾的影响最为显著［18］。在延长SCS 持续时间后，将肾脏放置在HMP 上也可以降低DGF。有两项研究中发现，对较长时间SCS 的肾脏进行额外的HMP，可以使DGF 发生率下降［19-20］。

2.1 HMP 的相关问题

2.1.1 压力控制与流量控制的对比：关于机械灌注采用压力控制还是流量控制更优的研究数据有限。Wszola 等［21］在压力基础和流量基础系统之间进行的一项前瞻性试验中发现，DGF 的发生率相似，但压力基础中的DGF 持续时间短，移植物的1 年存活率也较好。DGF 发生率较低被认为是因为在控制压力的情况下，剪切力和内皮功能障碍较少。

2.1.2 HMP 的最佳持续时间：HMP 的最佳持续时间尚不完全清楚。Patel 等［22］对190 个肾脏进行机械灌注研究，结果发现在2 h 内可以达到平均流量目标，在灌注后4 h 和6 h，流量参数并没有继续改善，而且DGF 发生率没有下降。此外，本研究发现，持续机械灌注确实可以降低移植器官的废弃率（20%对34%，P ＜0.05），但以较高的DGF 发生率（64%对39%，P ＜0.05）为代价，对死亡删失的移植物存活率没有任何影响。其他研究［23］提示增加灌注时间对DGF、SGF、移植物和患者存活率没有明显的影响。

2.1.3 用灌注相关参数评价和优化肾脏的活力：研究表明［24］，如果流量大于100 ml/（min·100 g），肾脏灌注会更好，如果流量小于80 ml/（min·100 g），则会出现低灌注。在欧洲机械灌注临床试验中［14］，灌注压力保持在30 mmHg（1 mmHg ＝0.133 kPa）。肾脏阻力指数是以mmHg 为单位的平均灌注压力与以ml/min 为单位的通过肾脏的流量之间的比率。在Bissolati 等［25］所做的一项研究中，如果在机械灌注后1 h 内肾脏阻力指数达到1.0 以下，PNF/DGF的发生率会降低，同时肾脏恢复更快。

机械灌注泵参数，如阻力指数和灌注流量指数，在预测边缘肾和DCD 供肾的DGF 和移植物结局方面似乎具有更大的区分价值。在最近一项［26］对58 例DCD/ECD 肾脏进行机器灌注的研究中，发现1 h 阻力指数＝0.4 是预测DGF（敏感性为61.54%，特异性为81.25%）和更高的1 年血清肌酐水平的最佳分界点。在另一项对446 个DCD 供肾的研究中提示在非ECD 供肾中，如果终末灌注流量增加到大于100 ml/min，DGF 发生率显著降低（P ＜0.05）［27］。此外，终末肾脏阻力指数是预测DGF 的最重要参数（OR ＝2.44；P ＜0.001）。

2.1.4 基于灌注参数所做出的肾脏废弃决定：在一项研究中［8］，与未采用机械灌注相比，采用机械灌注的ECD 供肾的丢弃率小。丢弃率与肾脏阻力指数相关。阻力指数大于0.26 的肾脏被丢弃的更多。然而，也有其他研究发现，尽管灌注后的阻力指数和流量参数并不理想，SCD 和ECD 供肾的移植和患者预后却很好。因此，机械灌注的流量参数不应作为丢弃肾脏的独立判断标准。2020 年的一项研究［29］发现HMP 期间的RR 趋势与ECD 肾脏的组织学活检评分有很好的相关性，并且在灌注120 min 时，0.88 的临界值在区分低评分和高评分方面具有很好的准确性，HMP 期间的RR 趋势与ECD 肾脏的组织学评分相关，可作为评估移植物质量的可靠参数。

2.2 HMP 的其他研究方向：移植物在冷保存并再灌注后，突然恢复常温条件，需要大量的能量，而仍处于低温麻痹状态的细胞尚未满足这一需求。因此，有人提出了一种通过离体机器灌注阶梯升高移植物温度的方法。2020 年Minor 等［30］首次报道了在移植前用无细胞的灌注液进行控制性复温和常温灌注的临床病例，取得了良好的效果。2022 年同一团队发表了第一个临床试验研究［31］，6 个ECD 肾脏在植入前应用机器灌注期间接受受控的阶梯升温。对照组为常规冷保存配对肾脏。阶梯升温从10℃开始，在持续灌注期间，温度分别在30、60、75 和90 min 后缓慢升高至17℃、30℃和35℃。在35℃的最终稳态期间，灌注压力从30 mmHg 平行调整至75 mmHg。这项研究在低温灌注和随后的复温期间，持续向氧合器供给1 L/min的100%氧气，从而使氧气充分输送至移植物。研究结果发现COR 可显著改善移植后的早期同种异体移植功能。术后第7 天，COR 后肌酐清除率和钠排泄分数在正常范围内高出2 倍以上，显著高于对照组。COR 可以安全地应用于移植肾，是预测和改善移植肾早期功能的有价值的工具。

在肾移植供肾中采用低温氧合机灌注（hypothermic oxygenated perfusion，HOPE）目前已经开展了临床前试验［32］。一项研究关于HOPE对ECD 的影响文章已经发表，这项研究中对15 例ECD 在缺血结束后进行（152±92）min 的HOPE，并与接受CCS 的肾脏匹配进行比较，结果发现DGF发生率没有差异（分别为53%和33%；P ＝0.197），与CCS 组相比，HOPE 组术后血清尿素水平较低（P ＝0.003），而CCS 组术后第7 天和第14 天的血清肌酐水平较低，eGFR 率较高。

3 亚常温机械灌注

关于机械灌注温度的研究有很多。Brasille 等［33］在32 ～ 34℃的亚常温温度下，利用一种称为无血性代谢支持（exsanguinous metabolic support，EMS）的灌注系统进行了灌注研究，应用动物研究表明，延长EMS 使用时间可以降低血清肌酐峰值，改善冷缺血损伤。作者对废弃的人肾脏进行了研究，得出了类似的结果。

4 常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）

NMP 的概念并不新鲜。1930 年，Carrel 和Lindbergh 试图在接近生理的条件下稳定人体器官时，采用了NMP 这种方法。但近一个世纪以来，NMP 在技术上一直存在很大的挑战性，而且由于SCS 和HMP 对器官的储存效果令人满意，NMP 的发展一直停滞不前。近年来，随着更多边缘肾脏的应用和简易体外循环装置的开发，移植后DGF 的发病率不断增加，人们对NMP 的使用重新产生了兴趣。

NMP 将器官维持在接近生理的温度和压力下，所应用的灌注液是一种携氧载体（通常以红细胞为基础）。NMP 的潜在优势包括避免冷缺血损伤和ATP的生成。此外，还可以对供肾功能进行评估，监测尿量，并在机器灌注期间提供治疗使移植物损伤加快修复。尽管在动物模型的研究显示移植物功能都取得了良好的结果。但是仅在过去几年中，NMP 的使用才从动物实验转向人类使用。Hosgood 等［34］于2011 年首次在人肾脏移植中进行了NMP 体外试验。2013 年，同一研究小组发表了第一项NMP 的临床研究［35］，共计18 个ECD 供肾，灌注平均温度为34.6℃，平均时间为（63±16）min，灌注液为无血浆红细胞溶液。对照组为47 例采用低温静态冷保存的ECD 供肾。NMP 组的DGF 显著降低（5.6%比36.2%，P ＝0.014），但1 年时的移植物或患者存活率无任何差异。作者［36］最近提出了一个NMP质量评估分数，用3 个标准来评估肾脏质量：宏观外观、平均肾血流量和总尿量。利用这些参数进行评估，研究者对5 个最初被所有移植中心认为不适合移植的肾脏采用NMP，结果5 例移植后有4 例无DGF。通过这样的灌注方法，期望可以通过降低边缘肾和DCD 肾的丢弃率来缓解器官短缺。2021 年，一项关于单纯HMP 与HMP 后额外2 h 的NMP 的单中心、开放、随机对照临床试验已经开始［37］，纳入供体为ECD 和DCD，期望获得NMP 对HMP 的额外附加价值。

总之，根据目前的证据，NMP 似乎比SCS 更具优势。NMP 的最佳持续时间尚不清楚，理想的灌注液也是如此。在当今时代，它在技术上具有挑战性，每次移植的成本也更高，但通过减少DGF 和增加其他废弃肾脏的使用，它最终可能对卫生经济学更有利。临床试验正在进行，以确认最初的有利发现，并扩大其使用范围。

5 机械灌注中的生物标志物

由于机械灌注循环液体的生化特性是已知的，因此可以通过分析灌注中生物标记物来评估器官活力和组织损伤程度。移植中常用的生物标志物有乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）、N-乙酰-b-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-Dglucosaminidase，NAG）和心脏型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid binding protein，H-FABP）。GST 水平与热缺血时间（warm ischemia time，WIT）密切相关，也是DGF 的独立危险因素。较高的NAG 和H-FABP 水平提示存在DGF 的高风险，但在区分移植物功能方面没有预测价值。与DBD 和活体供肾相比，DCD 供肾中LDH、NGAL、MMP-2 等其他组织损伤标志物的水平更高。组织损伤的非特异性标记物，如LDH，在WIT 或移植物功能之间没有显著相关性，最好与其他生物标记物结合使用，而不是单独使用。

把生物标记物与机械灌注相关参数综合分析，具有更高的实用性。最近，细胞外组蛋白和microRNA-21（miR-21）的灌注水平引起了许多研究者的注意。在一项对390 例DCD 供肾进行组蛋白分析的研究中［38］，发现组蛋白水平与PNF、DGF和1 年移植失败的风险有相关性。在另一项研究中，在HMP 组的11 个ECD 供肾中，移植后6 个月和12 个月，MiR-21 水平与eGFR 的水平相关。器官质量的评估非常重要，因此需要在更大的试验中验证此类新型生物标记物的研究结果。

6 间充质干细胞在机器灌注中的应用

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种多能细胞，可减轻免疫和炎症反应，促进组织修复。MSC 具有可再生和低免疫原性等特征。Gregorini 等［39］最近在大鼠DCD 移植模型上进行的一项研究中发现，在灌注液中补充MSC，且从MSC 分离的细胞外小泡，可改善组织病理学，上调细胞能量代谢和膜转运的基因，降低灌注液缺血和损伤生物标记物的水平。在人类肾移植中［40］，已经证实经静脉输注MSC 对移植物或患者存活没有有害影响。对这些输注MSC 的患者进行5 ～ 7 年随访，发现这些患者循环记忆CD8 阳性T 细胞百分比降低，调节性T细胞/记忆性CD8阳性T细胞比率长期增加，允许少数患者的免疫抑制显著减弱［41］。在一些初步研究中［42］，将MSC 注入移植物可以减少免疫抑制剂并诱导免疫耐受。因此，机器灌注有可能为一些新的疗法提供可能，例如将MSC 注入灌注器官的环境中，并且由于灌注器官内更具耐受性的免疫表型，因此可能允许较低的免疫抑制剂。