机械灌注联合间充质干细胞在肾移植中的运用

欧志宇，苗芸（南方医科大学南方医院器官移植科，广东 广州 510515）

肾移植通常是终末期肾病首选的治疗方法［1-2］。然而，在全世界范围内，肾源短缺成为肾移植的主要障碍。为了满足日益增长的需求，越来越多扩大标准捐赠者（expanded criteria donor，ECD）和心死亡后捐赠者（donation after cardiac death，DCD）来源供肾被用于移植。然而，与标准捐赠者（standard criteria donor，SCD）供肾相比，ECD 或DCD 供肾质量较差，更容易遭受缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI），导致移植肾功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）、急性排斥风险增加以及移植物存活率降低。为减少IRI，提高供肾质量，改善患者预后，需要采取更好的器官保存策略。机械灌注（machine perfusion，MP）技术的发展为器官保存带来新的前景，其在多个方面显示出优于传统保存方法的优势，特别是在保存期间治疗和修复器官的潜力［3］。多种治疗干预措施已被用于MP 期间的器官，其中，间充质干细胞（mesenchymal stromal cell，MSC）因其抗炎、再生和免疫调节作用而被认为是一种很有潜力的治疗策略［4］。本文总结了MP和MSC 在肾移植中的进展，并强调了这两者联合在未来改善实体器官移植结果的潜力。

1 机械灌注

随着大量ECD 和DCD 供肾被使用，器官保存策略逐渐从传统的静态冷储存（static cold storage，SCS）向MP 转变。MP 系统由泵、管道回路、灌注液、热量和氧气交换器以及控制系统等多部分组成［5］。将器官血管连接到MP 系统上，可以持续灌注离体器官以提供营养物质和氧气，并及时带走代谢废物。在这过程中，可以往系统中加入不同药物对器官进行治疗干预，以及多次抽取样本进行相关指标检测。根据温度的不同，MP 可以分为低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP，4℃）和常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP，37℃）。

1.1 HMP：目前，HMP 是肾移植中运用最广泛的MP 技术，其通过可控的方式向离体器官持续灌注冷保存液［6］。HMP 的作用机制与SCS 相似，通过低温降低器官的新陈代谢和需氧量来最大程度减少IRI。此外，HMP 还有助于维持eNOS 等关键基因的表达来保护血管内皮［7］，改善再灌注期间的循环。国内外多个临床研究已证实，HMP 较SCS 可有效降低DGF 的发生率，改善肾移植的结果［8-10］。一项包含15 个临床研究的荟萃分析显示，无论是DBD 还是DCD 来源的供肾，HMP 均能降低DGF 的风险［11］。在另一项回顾性研究中也得到了有关DGF 的类似结论［12］。部分研究还显示，HMP 组具有更高的移植物存活率［8-10］，但这种益处尚未在其他研究中发现。

1.2 NMP：为了进一步改善器官的功能，体外器官保存由降低新陈代谢向模拟细胞正常的生理环境转变，这导致了NMP 的出现。与HMP 相比，NMP 对技术要求更高，并且由于SCS 和HMP 较好的保存效果，人们一度失去对NMP 的关注。近年来，由于边缘器官的大量使用，DGF 的发病率不断升高，同时NMP 技术不断发展，使得人们重新重视起NMP。NMP 可向器官灌注常温含氧保存液来维持细胞正常新陈代谢，从而避免了冷缺血损伤，更好保存了器官功能。目前，NMP 已成功运用到临床肝脏、肾脏和肺移植中，并显示出改善移植物功能的潜力。Nasralla 等［13］在2018 年报道了第一个有关NMP 在肝移植中运用的国际性多中心随机对照试验，发现NMP 较SCS 能显著改善肝移植的结果，并降低了等待肝移植患者的病死率。这项研究说明NMP 是一种切实可行的技术，对其转化为其他固体器官移植具有重要意义。Hosgood 等［14］于2011 年报道了NMP 在肾移植中的首次运用，并在随后发表了第一个单中心临床试验，结果显示NMP 在降低DGF 发生率方面优于SCS（5.6%比36%）［15］。另外，该小组还提出了一个基于NMP 的评分系统来评估移植前DCD 肾脏的质量，将一些原本会被丢弃的肾脏成功用于移植，这有助于提高边缘供肾使用率，缓解器官短缺［16］。更重要的是，NMP 接近常温的微环境为细胞治疗提供了一个靶向器官的平台。NMP 可将治疗用的细胞直接输送到器官，减少全身暴露的不良反应。在众多细胞疗法中，MSC 具有抗炎、再生和免疫调节的潜力，其与NMP 联合使用有望进一步改善肾移植结果。

2 MSC

MSC 是一群具有自我复制能力和多向分化潜能的异质性成体干细胞，最早在骨髓中发现，随后人们在脂肪组织和脐带组织中也分离出MSC［17］。目前使用的MSC 主要来源于骨髓，但脂肪和脐带组织来源的MSC 因其数量多、创伤小也被广泛使用，同时也使用来自肌肉、牙齿的MSC［18］。不同来源的MSC 之间存在微小差别，尚不清楚这是否对治疗效果产生影响［19］。鉴于MSC 来源和分离方法的多样性，国际细胞治疗学会在2006 年制定了MSC 体外鉴定的标准［20］：① 贴壁生长；② CD105、CD73 和CD90 阳性率大于95%，CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR 阳性率小于2%；③ 具有向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。此外，MSC 不表达MHC-Ⅱ类分子，低表达MHC-Ⅰ类分子和共刺激分子，这使得MSC 具有很好的低免疫原性，不易被受者的免疫系统识别［21］。

MSC 的治疗作用及机制：MSC 因其独特的抗炎、促进组织修复和免疫调节特性，在肾移植及其它实体器官移植领域有着广泛的运用，该过程有赖于MSC 强大的旁分泌能力。MSC 可以分泌多种细胞因子和生长因子，调节局部的免疫微环境从而影响离体器官的炎症、组织再生和免疫反应过程［22］。另外，MSC 与免疫、内皮等细胞间的直接接触也是发挥作用的关键。细胞间接触形成的纳米管隧道可作为细胞间的通讯方式，促进线粒体、离子和RNA等物质的交换［23］。

在大鼠肾移植模型中已证实，动脉注射MSC可以减少免疫细胞在肾脏的浸润、降低炎症基因表达和改善早期肾功能［24-25］。MSC 减少IRI 的抗炎能力与其通过分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等介质来抑制巨噬细胞激活以及促进巨噬细胞向M2 极化有关［26］。MSC 还可以向受损组织迁移，通过分泌可溶性因子来刺激附近细胞进行组织修复，这些因子具有抗凋亡、抗纤维化和促血管生成的作用［27］。另外，MSC 来源的细胞外囊泡（extracelluar vesicle，EV）也被认为是一种特殊的旁分泌因子。EV 中含有多种生物活性分子，包括蛋白质、miRNA 和mRNA，这些物质释放到靶细胞后可以调节细胞功能，并且EV 还可通过转移细胞器来促进细胞存活［28］。

除了减少IRI，MSC 在肾移植中的另一个重要作用是调节受者免疫系统。动物移植模型显示，MSC 可以抑制T、B 细胞的增殖、抑制树突细胞的成熟、促进调节T 细胞（regulatory T cell，Treg）的增殖来治疗急性排斥反应和诱导免疫耐受［29］。目前，临床上开展了Ⅰ/Ⅱ期试验来评估MSC 的安全性和有效性。Perico 等［30］报道了在2 例活体肾移植受者术后第7 天静脉输注自体骨髓来源MSC（bone marrow-MSC，BM-MSC）的效果，发现2 例患者的Treg 百分比逐渐增加，而CD8+T 细胞增殖减少。在后续长期随访中1 例患者停用了免疫抑制剂，且没有出现排斥反应［31］，这为单次使用MSC 诱导长期免疫耐受提供了证据。一项前瞻性研究显示了MSC减少免疫抑制剂的作用，供体来源MSC 联合低剂量他克莫司的效果与标准剂量他克莫司方案类似，急性排斥发生率、移植物功能和移植物存活率没有差异［32］。此外，Reinders 等［33］报道了自体BM-MSC 治疗亚临床排斥的效果，发现大部分受者的T 细胞功能受到抑制，并且组织学上观察到小管炎症的消退。

总的来说，MSC 在肾移植中的运用主要集中在减少IRI、降低急性排斥发生率以及减少免疫抑制剂用量甚至免疫耐受，而介导这些过程的机制包括，MSC 旁分泌多种可溶性因子和EV 以及细胞间直接接触互作。

3 机械灌注联合MSC

尽管MSC 在肾移植领域取得了一些令人鼓舞的结果，但是静脉输注MSC 具有一定的局限性，这限制了MSC 在临床上进一步使用。首先，静脉输注会使MSC 主要驻留在肺的毛细血管中，不向受损的肾脏迁移，有导致肺栓塞的风险［34］。其次，静脉给药会增加全身暴露的风险，引起不必要的不良反应。最后，静脉输注对MSC 数量的可控性较小，数量少容易不起作用，数量多时易造成肺栓塞。而将MP 与MSC 结合可有效避免以上问题，MP 在体外可绕开肺屏障将MSC 靶向输送到肾脏，以及更加自由地控制灌注系统中MSC 的数量，实现局部给药优化治疗效果。

为了探究MP 联合MSC 的可行性，Parraga 等［35］率先研究了NMP 条件对MSC 的影响。研究发现，悬浮状态和冻融过程都会不同程度降低人MSC 和猪MSC的存活率。并且冻融过程还会增加氧化应激，降低MSC 与内皮细胞的黏附能力。尽管NMP 所需的条件对MSC 产生了一些负面影响，但MSC 分泌的生长因子和细胞因子却未受到明显影响，这为MSC 在NMP期间输注的可行性提供了重要证据［35］。

Pool 等［36］则研究了NMP 期间向猪肾灌注人源MSC 的可行性。猪肾在常温下灌注7 h，并在灌注液中加入人脂肪组织来源的MSC（adipose tissue-MSC，AT-MSC）以及荧光标记的人BM-MSC。结果发现，NMP 期间所有肾脏均有功能（消耗葡萄糖和氧气，产生尿液），并且在部分肾小球中检测到结构完整的MSC。这说明NMP 期间MSC 可以到达并驻留在肾脏，且保留潜在的生物活性。该小组随后发现，在猪肾NMP 期间加入人MSC 可降低损伤标记物中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL） 和 乳 酸 脱 氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）水平，提高肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）水平［37］。这为MP 联合MSC 可减少肾脏IRI 提供了进一步证据。另外，据报道，MP 期间MSC 还能通过重编程能量代谢所需的关键酶来保护肾脏免受IRI［38］。

Lohman 等［39］在猪肾自体移植模型中进一步评估NMP 联合MSC 治疗的肾脏用于移植的可行性、安全性和潜在获益。猪肾先后经历热缺血和HMP来模拟IRI，然后在常温下灌注240 min，并加入人或猪来源的AT-MSC。该肾脏用于自体移植，并监测移植后14 d 内潜在的MSC 治疗相关的肾脏改善情况。结果发现，NMP 期间加入MSC 不影响血流动力学，对移植早期结果也没有产生不良影响。在14 d 内，MSC 不影响血肌酐、肾小球滤过率、NAGL 和组织学损伤评分。这说明，在肾脏离体NMP 期间输注MSC 是安全可行的，尽管在移植后早期尚未发现MSC 治疗的获益。

除了临床前动物模型，MP 联合MSC 在人类肾脏中的运用也有报道。Brasile 等［40］评估了MP联合MSC 加速IRI 肾脏修复的潜力。该研究采用的是一种类似NMP 的无血代谢支持（exsanguinous metabolic support，EMS）平台，对5 对丢弃的DCD供肾进行24 h 灌注，其中配对肾脏添加MSC。结果发现，MSC 治疗可以导致肾脏合成炎症因子减少，ATP 及生长因子合成增加，细胞骨架正常化。更重要的是，与单独EMS 灌注相比，MSC 处理的肾脏显示出有丝分裂的细胞显著增加，这首次证明了人类IRI 肾脏在离体灌注下是可以实现再生的［40］。另外一个小组也报道了在NMP 期间使用多能成体祖细胞（multipotent adult progenitor cell，MAPC）对人类DCD 肾脏进行修复的证据［41］。MAPC 与MSC 非常相似，本质上是不同培养和扩增方案的产物［42］。研究结果显示，接受MAPC 治疗的肾脏尿量生成增加，损伤标志物NGAL 减少，并且超声造影提示MAPC 组的肾脏微循环和灌注得到了改善［41］。这种有益的结果可能得益于促炎因子向抗炎因子转变。

4 总 结

目前关于MP 联合MSC 在肾移植领域运用的研究较少，大部分研究集中在可行性和安全性上。尽管部分研究展示了两者联合在治疗和修复器官上的潜力，但其临床相关性和治疗效果的具体机制仍未明确。另外，关于MP 期间使用MSC 的最佳剂量、灌注时间以及MSC 的种类（自体或异体），在这些问题上人们还没有达成共识。此外，使用MSC 有潜在的过度免疫抑制以及恶性肿瘤风险，但目前还未发现MSC相关的直接毒性、恶性肿瘤和感染的报道。因此，未来还需要更多的研究来证实两者联合运用的益处和潜在机制。总的来说，MP 提供了一个靶向治疗、修复和再生的器官保存平台，而基于MSC 的抗炎、再生和免疫调节作用，这两者的联合对于治疗器官、提高器官质量和增加供体器官使用率具有重要意义。