亚常温机械灌注在边缘器官移植中的研究进展

梁诚，满江卫，邓然，杨立（兰州大学第二医院泌尿外科，甘肃 兰州，730030）

临床上日益增长的器官移植需求与供体短缺之间的矛盾严重制约了器官移植事业的发展，扩大供体来源并提高有限器官资源的利用率是全社会亟待解决的重大问题，目前最有希望的策略是提高边缘移植物的利用率［1-2］。边缘器官是指来自扩大标准供体（extended criteria donor，ECD）和心脏死亡器官捐献（donation after circulatory death，DCD），而不是标准供体（standard criteria donor， SCD）。这些器官大多在获取前均存在不同程度的原发性病理损伤（如脂肪变性）或经历较长的缺血缺氧性损伤［3］。边缘器官的纳入虽然一定程度上缓解了器官资源的紧缺，但在实际临床工作中常常因为考虑到移植物存活率和受者的安全性而放弃一些边缘器官的移植，此外还有一部分边缘器官由于没有合理的保存、评估和维护措施而丢弃，造成一定的资源浪费［4］。因此，需要不断探索更加先进的器官保存、评估和修复方法以满足临床需求。

由于低温可以降低组织代谢水平，提高器官对缺血的耐受性，人们认识到最早的器官保存方法是将离体的器官放置在冰盐水中以延长保存时间。此后不久，相继开发出不同的器官保存液以优化保存方案，直到今天这种静态冷保存（static cold storage，SCS）的方案仍作为金标准在临床广泛使用［5］。虽然SCS 已经使来自标准供体的器官移植产生了良好的结果，但由于边缘器官自身的问题，冷保存后的器官更容易早期移植物功障碍、原发性移植物无功能、移植物功能延迟恢复、缺血性胆管病等术后并发症，影响移植预后［6］。器官资源短缺的现状推动了新型、更先进的器官保存技术的发展，以增加这些次优资源的可用性。基于机械灌注（machine perfusion， MP）的器官保存策略可以集保存、转运、术前评估、修复于一体，目前已经受到移植领域的广泛关注［7-10］。

1 亚常温机械灌注的理念

目前，临床上比较成熟的机械灌注方案多使用低温机械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）和常温机械灌注（normothermic machine perfusion，NMP），虽然已经明显改善一些移植物的活力，但在实际应用中仍出现一定的弊端。HMP 作为最早的机械灌注方案，可以在保存过程中降低组织的代谢水平，同时通过循环灌注去除代谢废物并保持血管内流体剪切力的稳定和减轻内皮糖萼损伤［11］。然而，一个尚未解决的问题在于长时间的冷保存引起细胞对移植后温差变化的敏感性，并由此导致器官实质细胞线粒体功能障碍和促凋亡信号转导，这种“复温性损伤”可能是导致器官再灌注损伤和移植物功能障碍的潜在诱发因素［12］。虽然NMP 可能比HMP的灌注效果有所改善，但它仍然使缺血后的器官暴露于快速升温的环境，同时保存温度的提高意味着器官更高的代谢水平，因此，需要特定供氧载体和灌注液来维持器官组织的有氧代谢，阻碍了其广泛应用于临床［13］。鉴于此，有学者提出亚常温下的机器灌注模式（subnormothermic machine perfusion，SNMP），该方案克服了低温下的器官代谢缓慢与生理温度下高代谢引起的组织缺氧，可以在延长器官保存时间的同时使移植物维持相对较高的生理代谢水平［13］。

2 SNMP 的优势

作为一个有效的综合性器官保存系统，SNMP可以通过以下方式扩大有限的供体库：① 通过维持器官保存期间所需代谢物质的正常补给，延长器官保存时间；② 模拟体内灌注环境，清除器官中的微小血栓、去除有害代谢废物、改善微循环，这在一定程度上对供体器官起到了修复作用；③ 可以在近生理状态下对灌注液和器官排泄液的相关指标进行多组学分析，构建移植指数，更加精准地评估器官是否适合移植；④ 通过多维度的分析数据，对器官采取有针对性的干预措施，改善边缘器官的质量；⑤ 室温下的SNMP 通过消除对温度控制的需要而提高了设备的便携性，同时受益于亚生理温度下较低的代谢需求，可以简化甚至消除供氧系统，因此更加便捷技术的应用和推广。

3 SNMP 的组成

SNMP 装置提供了一个封闭保存环境，能够在无菌条件和特定温度下（广义的亚常温一般指温度为20 ～30℃）通过灌注泵来模拟体内血供环境，其主要组成部件包括滚轮泵、氧合器、灌注液、器官保存室和循环回路检测装置等。灌注液作为机器灌注中的载体，通过对其成分进行分析或适当改造，还可以使SNMP 具备器官活力评估和修复的功能。

4 SNMP 在器官移植中的应用

作为最新的器官保存技术，体外SNMP 技术正在进行临床转化，并且已经在边缘器官保存、评估和修复方面展现出一定优势。

4.1 边缘器官保存：在DCD 动物肾移植模型中，Hoyer 及其同事评估了CS、低温氧合机械灌注（oxygenated hypothermic machine perfusion，HMPox）和SNMP 3 种技术的短期保存效果，结果显示，与HMPox 和SCS 相比，使用SNMP 保存7 h 后供肾血流量和尿量显著增加，且与金标准CS 相比，SNMP组肌酐清除率增加了10 倍，组织学标本检查也显示出亚常温机械灌注更好地保留了肾组织的结构完整性［14］。Ciria 等［15］将废弃的人体肝脏应用于SNMP研究，虽然最终无法确定移植后效果，但反应肝脏活力的指标如乳酸水平的下降和胆汁排出量明显改善已经说明SNMP 装置在挽救严重边缘肝脏方面的潜力。肝脏脂肪变性增加了肝脏对缺血/再灌注的敏感性，且和移植术后并发症的发生率显著相关。与金标准冷保存相比，SNMP 可以明显改善中度脂肪变性肝细胞的氧化应激和组织炎症［16］，降低肝酶水平，电子显微镜下发现SNMP 减轻了保存过程中的肝窦内皮细胞和肝细胞的线粒体损伤，成功保护中度脂肪肝免受保存/再灌注损伤［17］。在另一项基于大鼠肺移植模型的研究中，Arni 等［18］对冷缺血后的肺脏进行4 h 体外肺灌注（ex vivo lung perfusion，EVLP ）并进行移植，以探究亚常温下的肺保存效果。与常温灌注相比，亚常温下的体外肺灌注改善了肺动态顺应性和血管阻力，并减少了组织炎症反应，从而说明亚常温EVLP 具有减轻移植过程中缺血/再灌注损伤的作用。此外SNMP 和其他保存方案的联合使用也展现出更好的潜力［19-20］。通过将临床上判定为不适合移植的肝脏在-4℃下过冷储存，在过冷的预处理和复温阶段使用SNMP，可以有效地将器官的体外保存时间延长到27 h，并可以达到移植的标准［21］。因为不同研究之间的器官质量和灌注方案存在差异，也导致一些研究得出了不同结果［22］。为此Huang 等［23］建立了一个体外劈离式肝脏灌注模型，该模型允许同时灌注左右叶，并将一个叶作为另一个的对照，有效避免了以往研究中因研究器官的异质性带来的问题。目前研究发现，SNMP 可以通过改善保存期间器官微循环障碍，减轻炎症反应，维持实质细胞线粒体功能稳态和减轻氧化应激反应从而增加边缘器官对缺血/再灌注过程的耐受。

4.2 边缘器官的评估：除了提供良好的保存环境和减轻缺血/再灌注损伤外，SNMP 还为评估器官状态提供了更加客观可靠的平台。以往判断器官移植的适宜性是根据临床经验确定的评分体系，这些评分指标已被证明和移植物成活率和术后并发症相关，每个移植中心都有自己的判断标准，很难大范围推广使用［24］。而结合机械灌注参数的评估，如灌注流量和阻力参数、分析循环灌注液中的一系列生物标志物等，可以为临床医生提供更客观的参考。在几项研究中，器官灌注阻力显示出在评估器官质量和功能的潜力，灌注期间较低的灌注阻力与再灌注期间的更好的功能相关［25］。然而，尽管这些灌注参数可以一定程度上反映器官的损伤程度，但它们确定移植后效果的可靠性有限。器官组织的代谢物可反映体内的生理和病理状态，应用组学的研究方法对代谢产物中进行分析，既可以区分同种不同个体之间功能差异，同时还可以了解生物体在应激状态下的代谢变化，以便改善器官的代谢情况。国外有学者通过对灌注液的代谢组学分析将具有相似代谢模式的器官进行聚类，从而筛选出更适合的器官进行移植［26］，有利于提高移植的成功率。在机器灌注期间，还可以通过对移植物代谢产物的组学数据分析可以更好地阐明器官保存和恢复中涉及的病理生理变化，探索这些机制将有助于发现新的干预靶点，从而用于在移植前进行精准器官治疗［27-28］。器官学研究领域的未来工作可以结合机械灌注开发用于分析的多组学数据计算平台，包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学数据，以更好地构建边缘器官地移植指数，提高移植的成功率。

4.3 保护和修复边缘器官：在体内，要实现对特定器官的治疗往往需要借助全身给药，特异性较低，同时在确保疗效的同时又需要增加药物的剂量，对其他器官也产生额外的损伤。而基于SNMP 平台的药物治疗通过对灌注液的成分进行合理改造，如添加干细胞及其外泌体、基因治疗、小分子抑制剂、代谢产物补充及有效载体等方法。直接将药物递送至靶器官，有效避免了全身治疗带来的不良反应，更好地发挥SNMP 的器官修复作用。

4.3.1 间充质干细胞及其外泌体：间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类来源广泛、具有强大免疫调节和组织再生功能的一类干细胞，近年来在器官移植领域引起了广泛关注［29-31］。最初认为 MSCs 分化为各种细胞类型的潜力对其治疗效果起着关键作用，但后来的体内研究发现，通过静脉输注MSCs 后，只有少部分保留在靶器官中，且体内存活时间短，很难发挥其直接修复作用［32］；虽然增加剂量可以一定程度上解决这个问题，但微血管栓塞的风险和对其他器官的不良反应也会增加［33］。SNMP 可以为 MSCs 相关治疗提供一个理想的平台，通过在灌注液中加入MSCs，克服体内治疗的特异度较低的问题，进而达到直接修复靶器官的目的［34］。近年来研究发现 ，MSCs 还可以通过旁分泌调控机制在器官移植过程中发挥保护作用，其中细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是其分泌的主要功能单位［35］。EVs 包括外泌体和微泡，是一种由mRNA、miRNA、大量蛋白质和脂质等物质组成的囊泡状物质，参与细胞间信号调控。作为细胞疗法的新型替代品， EVs 可以长期存贮并维持其功能，且和灌注液具有更好的兼容性，因而未来具有更广阔的应用前景。

4.3.2 基因治疗：器官基因工程治疗可以通过特异性调节移植物内基因来实现对移植物功能的调控。慢病毒载体作为一种成熟的基因调控手段，可以实现对细胞和组织的永久性基因改造，然而目前临床应用中除了难以实现纯化和引起全身不良反应的可能性，体内导入时因缺乏特异性并且产生脱靶效应也是一大技术障碍。而在离体器官灌注期间，慢病毒载体介导的基因调控可能提供一种可以稳定生产基因工程器官的方法［36］。内皮系统参与并调节器官功能的多个过程，如炎症或血栓形成等。肾血管内皮上的HLA 表达作为强烈的抗原刺激，同时是同种异体免疫应答的主要驱动因素和靶标。国外有学者在大鼠肾移植模型中使用RNA 干扰技术下调MHC-Ⅰ类和Ⅱ类转录序列，显示携带特定RNA 序列的慢病毒成功诱导MHCI 类和MHCII 类转录产物持续稳定下调［37］。作为一种降低移植物免疫原性的策略，该方法可以有效减少免疫抑制剂的用量，甚至诱导受体对移植物的免疫耐受性。

4.3.3 抑制剂干预：最近的研究已经注意到器官保存过程中产生的炎症分子的存在，并且可能随着灌注时间的延长而逐渐积累。有学者发现，在MP 期间炎症细胞因子的积累归因于组织常驻白细胞的释放。此外，在保存过程中受损的移植细胞将各种损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）释放到灌注液中，并与上调的模式识别受体（toll-like receptors， TLR）结合，启动具有放大效应的炎症反应［38］。未来可以通过去除循环 DAMP 和细胞因子、抑制 TLR 信号传导和选择炎症小体的特异性抑制剂来减轻这种炎症反应。

4.3.4 代谢产物的补充：器官移植过程中伴随着移植物代谢状态的改变，而改善移植物功能的一种潜在方法应用代谢组学数据对其进行分析，并靶向其病理性代谢过程。通过对亚常温机械灌注后的脂肪肝进行代谢组学分析，尽管接受SNMP 的脂肪肝能够增加ATP 和能量电荷比率，然而脂肪肝表现出谷胱甘肽合成障碍［39］。作为体内重要的抗氧化剂，其合成受损可能增加脂肪肝的氧化应激水平。因此在灌注液中额外补充抗氧化剂，如谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸或维生素E，以缓冲再灌注期间的谷胱甘肽消耗，减轻氧化应激水平［40］。

4.3.5 氧气载体：氧合在低温机械灌注中表现出有利的效果，并且在常温机器保存中是必需的，而对于在SNMP 中使用氧载体是否有益，目前还没有达成一致的结论。有学者认为，随着机械灌注温度的升高，器官需氧量增加，因此，为了维持保存期间的代谢供应，有必要在保存系统中引入一个氧载体［41］。在部分研究已经看到含有携氧载体灌注液的良好效果。最初的氧载体使用血液作为灌注液，但很快发现具有局限性，包括血型匹配、长时间的机械灌注导致的红细胞破裂和潜在病原体的存在等缺点［13］，为此，研究者正在探索更加经济高效的氧载体。Shonaka 等［42］将血红蛋白囊泡作为氧载体加入到UW 溶液中，并对猪DCD 肝脏进行SNMP，这种方法改善再灌注期间肝脏的功能。还有部分研究采用了基于动物血红蛋白设计的氧载体（hemoglobin oxygen carrier，HBOC）。HBOC 是聚合血红蛋白，它与所有血型相容，不含任何传染性病原体，并且在室温下稳定至少3 年。Fontes 等［43］在猪肝移植模型中研究了SNMP 与 HBOC 溶液组合方案的灌注效果，多组学分析的证据表明，该方案能明显改善肝脏的炎症表型，增强肝细胞再生能力，并使得肝细胞的代谢活动转向正常。新型的全氟化碳氧载体（perfluorocarbon-based oxygen carriers，PFCOC）在生物学上是惰性的，在体内具有相对较短的半衰期（12 ～ 24 h），同时能够溶解大量的氧气，并且由于分子量小，对于最微小的毛细血管也可以达到良好的灌注效果，目前已被开发用于灌注体系内的氧气运输。搭载有PFCOC 的SNMP 体系显著改善了肺组织通气功能和氧合指数，降低炎症相关标记物［44］。

4.3.6 适宜的灌注液：尽管威斯康星大学（UW）冷藏溶液是最常用的冲洗溶液，并且在亚常温机械灌注的应用中也展现了良好的兼容性。但近年来发现其高黏度可能导致潜在的移植物灌注不良，此外，UW 中的羟乙基淀粉对红细胞产生过度聚集作用，妨碍了器官中红细胞的完全洗脱。因此未来仍需针对亚常温机械灌注开发出更加适宜的灌注液［45-46］。

4.3.7 抗菌药物：术后感染在器官移植中很常见，且已经成为术后患者死亡的主要原因［47］。在亚常温下，器官保存溶液中的高细菌污染的风险进一步增加，可能与供体器官中的内源性细菌相关或在获取过程中的外源性病原体引入［48］。除了在器官置入时的无菌操作外，同时需要选择合适的抗菌药物进行预防。理想的抗菌药物除了具备有效抑制微生物生长，同时不会对器官造成额外的损害。有研究指出，1000 μg/ml 头孢唑啉具有覆盖灌注期间可能的机会性感染，在亚常温保存期间具有杀菌作用，且可以维持较长时间［49］。更加科学的方法是留取器官灌注液进行的微生物培养，根据药敏结果指导后续抗菌药物的使用。

5 总 结

使用边缘器官来扩大可用供体库是一种有效的措施，可以在一定程度上缓解全球“器官资源”紧缺的现况，然而我们必须对这些资源进行妥善保存、精准评估和系统优化，以实现最大化利用。机械灌注已经在边缘器官保存过程中发挥重要的作用，基于亚常温的机械灌注作为一种新的技术方案为移植医生提供了更多的选择，而更简化的技术将有助于其推广应用。未来还需要进一步开展更多的基础和临床研究，以优化灌注程序，造福更多等待器官移植的患者。