细菌外膜囊泡调节宿主天然免疫反应机制研究进展

谢 臻，汤晶晶，沈锡辉，郭抗抗，徐 磊*

(1.西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

许多在兽医公共卫生和食品安全中有巨大危害的革兰氏阴性菌，如大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)等可以产生一种直径约20 nm～300 nm的球形的双层泡状结构，称为外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)，在细菌多种生理活动和致病性中发挥重要作用。OMVs的数量和组成可能取决于细菌的不同生长条件，其可以在细菌生长的所有阶段出现，且其释放量受到多个基因的影响。OMVs在其分泌过程中，会携带大量细菌细胞成分并将其转移至胞外或靶细胞内，也被称为细菌的0型分泌系统[1]。与其他分泌系统相比，OMVs可以分泌多种类型的生物大分子如脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白、细胞壁成分、蛋白质(周质、细胞质和膜结合)、核酸(DNA、RNA)等，还可以分泌一些小分子化合物和金属离子至胞外。

OMVs是细菌多种生理活动的重要参与者，对细菌的生存至关重要。OMVs可以在细胞间进行物质传递，其可以将自身所携带的生化大分子等转移至环境或靶细胞内。OMVs还可以杀死相互竞争的微生物，由一种细菌产生的OMVs可以杀死附近的其他竞争微生物，且当靶标细胞含有与OMVs产生菌相似的肽聚糖时杀灭效果最好。OMVs还可以包装抗生素，并以非常高的浓度将其运输到目标位置。除了细菌种间竞争的作用之外，细菌还可以释放OMVs来抑制噬菌体的感染，显著提高自身生存能力[2]。OMVs也可通过膜融合将其装载物转移到真核细胞，其可以利用宿主细胞的内吞作用向真核细胞传递生物大分子，这一过程并不依赖于OMVs和真核细胞细胞膜之间的融合，而是OMVs作为一个整体被转移至真核靶细胞。其进入真核细胞后，能够将其所运载的物质在靶细胞内释放，进而通过不同的方式调节宿主细胞的生理活动。OMVs自身所含有的多种蛋白质能够显著增强细菌感染宿主的能力。同时，OMVs所含大分子物质如LPS、核酸等同样可以参与调节宿主的天然免疫反应。本文将对OMVs的结构特征、分泌机制进行总结，并就OMVs及其装载物影响宿主天然免疫系统的方式和机理进行讨论，最后对利用OMVs开发有效治疗工具的可能性进行展望。

1 OMVs的结构与产生

OMVs是由细菌外膜(OM)包裹周质内容物、肽聚糖(PG)片段和核酸通过出芽的方式形成的。细菌OM的独特之处在于其脂质部分的不对称分布，其中外部富含脂多糖(LPS)，内部主要含有甘油磷脂[3]。OMVs的球形结构提供了更高的比表面积，因此LPS存在密度非常高。OMVs产生菌的体外生长条件主要有3种，即在固体和液体培养基上的生长、在生物膜中的生长以及在细菌感染宿主细胞期间的生长。细菌的生长条件对OMVs的形成过程有显著的影响，生长后期的细菌OMVs产量最高。此外，细菌外部环境如温度、营养耗竭和抗生素等因素会导致细菌增加OMVs的产生和OMVs中生化大分子的包装[4]。由于宿主细胞内部环境对于细菌是十分恶劣的，宿主与病原菌的相互作用也会影响OMVs的组成和产生。总之，OMVs的产生与组成十分不稳定，对细菌生长的外环境依赖性很强。

OMVs的分泌并不局限于特定的生长条件，在体内(生物膜介质或细胞培养物)和体外(固体或液体培养基)生长的细菌都可分泌OMVs。然而，细菌释放OMVs可能随着环境的变化而变化，特别是应激因素的影响，例如温度和酸碱度的变化、抗生素(庆大霉素和氯霉素)、某些微量营养素(如赖氨酸)、铁和血红素的限制或者噬菌体的感染[5]。通常当外膜凸起一小部分时开始形成囊泡，随后凸起的这一部分与外膜挤压分裂并形成囊泡状被释放。挤压分裂的过程尚不清楚，但是有一些因素如OM的组成和周质内分子的积累可能与这一过程有关。从热力学的角度来看，囊泡的形成是一个非自发的过程，但是相关形成机制的研究还较为有限[6-7]。

尽管对OMVs的研究早在50多年前就开始了，但还没有一个被广泛接受的OMVs的形成机制。基于OMVs组分的传递和一些生化试验的研究已经建立了一些假说，这些假说试图从分子水平解释OMVs的形成机制。一种假说认为，OMVs在膜的纳米区域内形成，在这些区域中积累着许多错误折叠的蛋白质或细胞膜的成分，如脂多糖和肽聚糖。当这些分子没有被细菌有效地内化到细胞质中进行降解和再利用时，它们就会积累并产生膨胀压力和OM的局部凸起[6]。一些科学家认为，OM外层的磷脂积累导致膜肿胀时产生OMVs是革兰氏阴性菌形成OMVs的普遍机制。OMVs的产生与磷脂运输系统的调节直接相关，磷脂转运系统可以对铁缺失做出反应。这是一种非物种特异性的机制，不依赖于膜的完整性或任何类型的压力[8]。目前关于OMVs的收集和纯化已经有了较为规范的方法，有助于OMVs的形成机制以及OMVs运输机制相关研究的开展。

2 OMVs调节宿主细胞天然免疫的信号通路

2.1 OMVs激活宿主天然免疫反应

近年来，对革兰氏阴性菌OMVs的功能，特别是其影响宿主细胞功能的研究十分广泛。OMVs因其携带有大量LPS，能够显著激活宿主细胞的天然免疫反应。研究发现，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)来源的OMVs能够刺激人中性粒细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)[9]。这些反应被γ干扰素(IFN-γ)进一步增强，这表明在存在IFN-γ的慢性炎症状态下，脑膜炎奈瑟氏菌OMVs诱导的免疫反应能够被增强。细菌OMVs也可以诱导中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的形成[10]。

OMVs亦可引起巨噬细胞的炎症反应。细菌OMV被巨噬细胞吞噬，然后通过NF-κB信号途径激活TNF-β、IL-8和IL-1β的产生[11]。牙龈假单胞菌(Porphyromonasgingivalis)OMVs使巨噬细胞产生更多的TNF-α、IL-12p70、IL-6、IL-10、IFN-β和一氧化氮[12]。此外，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)OMVs可促进炎性因子的释放，其在感染后期又可以促进细菌在巨噬细胞中的复制，从而有助于嗜肺军团菌在宿主中的扩散[13]。淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、致尿性大肠埃希菌(uropathogenicE.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)OMVs可以诱导巨噬细胞的线粒体凋亡和NLRP3炎症小体激活[14]。除了免疫细胞外，许多其他类型的细胞也可以对OMVs做出反应。嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)OMVs能在人肺癌细胞A549细胞中引起强烈的炎症反应[15]。大肠埃希氏菌(E.coli)的OMVs可以在人体肠上皮细胞中诱导免疫反应，并促进IL-8的产生[16]。

2.2 OMVs调节宿主天然免疫反应

除了能够直接激活宿主天然免疫反应之外，OMVs能够在与宿主细胞的相互作用过程中，通过其多种内含物调节宿主天然免疫系统[17]。下面将主要讨论OMVs包含的蛋白质、LPS、毒力因子、RNA等许多生化分子在调节宿主细胞天然免疫中的作用。

2.2.1 OMVs携带的蛋白质在宿主天然免疫中的作用 研究表明，OMVs中蛋白的缺失会显著影响巨噬细胞对OMVs的炎症反应。例如，在肺炎克雷伯菌的克隆相关临床分离株中，孔蛋白的丢失会显著影响巨噬细胞对OMVs的炎症反应。与表达一种或两种孔蛋白的菌株的OMVs相比，缺乏孔蛋白OmpK35和OmpK36的OMVs引起的促炎细胞因子分泌水平显著降低[18]。这一研究表明孔蛋白损失对OMVs的组成及其与吞噬细胞的相互作用均具有广泛而显著的影响，这可能影响宿主中细菌存活和炎症反应。此外，研究表明革兰氏阴性菌OMVs可以通过向宿主细胞传递鞭毛蛋白以激活NLRC4炎症小体[19]。

2.2.2 OMVs携带的毒力因子在宿主天然免疫中的作用 导致2011年大面积腹泻和溶血性尿毒症综合征暴发的高毒性大肠埃希氏菌O104∶H4菌株，在其生长过程中分泌的OMVs含有多种毒力因子。其主要包含志贺毒素(Shiga toxin，Stx)2a，是O104∶H4菌株的主要毒力因子，还包含志贺氏菌肠毒素1型、H4鞭毛蛋白和O104脂多糖。OMVs被内吞后与人肠上皮细胞结合并被其内化，向细胞内传递与OMVs相关的毒力因子，并诱导caspase-9介导的细胞凋亡和IL-8分泌。Stx2a是OMVs诱导细胞毒性的关键成分，而鞭毛蛋白和脂多糖主要诱导IL-8的分泌。这项研究证明了大肠埃希氏菌O104∶H4分泌的OMVs携带多种毒力因子能够导致人肠上皮细胞凋亡[20]。产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)中不稳定的肠毒素(LT)经由OMVs分泌，只有携带LT的囊泡才能以受体依赖的方式侵入细胞。这一发现说明ETEC OMVs作为专门针对性的运输工具，可以介导活性肠毒素和其他细菌包膜成分进入宿主细胞。

2.2.3 OMVs携带的LPS调节宿主天然免疫系统中的作用 LPS作为OMVs中最丰富的组分之一，在调节宿主的天然免疫系统中具有重要作用。胞外的LPS由细胞表面受体TLR4所识别，与MD2和CD14共同导致基因表达的转录调控。近年研究发现在细胞质内同样具有非TLR4依赖的LPS的识别受体，炎性caspases(人类中为caspase-4和caspase-5，小鼠中为caspase-11)被认为是细胞质LPS受体[21]。caspase-11结合胞质LPS导致其自身激活，与NLRP3和ASC一起诱导caspase-1激活。因此，LPS进入细胞质诱导的天然免疫反应与细胞外LPS对TLR4激活导致的天然免疫反应完全不同，说明LPS进入细胞质是许多细菌感染的重要步骤。在感染伯克霍尔德氏菌和志贺氏菌等胞内菌时，LPS可能会进入细胞质。然而，包括肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、霍乱弧菌(V.cholerae)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)在内的大多数胞外菌同样可以激活caspase-11，而OMVs似乎在这一过程中发挥重要作用[22-23]。

此外，在被网格蛋白介导的内吞吸收后，OMVs将LPS从早期内吞隔室输送到细胞质中。因此，OMVs激活细胞质LPS感受器，导致细胞焦亡和caspase-1激活，从而证明了OMVs在细菌感染期间细胞内LPS释放的重要作用。这一发现证明了OMVs作为LPS在细菌感染期间进入细胞质的重要手段。从更广泛的角度来看，该研究揭示了一种基本机制，该机制可以通过OMVs将病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)传递到细胞质以激活天然免疫系统[24]。此外，大肠埃希氏菌OMV-LPS具有在膀胱细胞内化时调节免疫应答的作用[25]。

2.2.4 OMVs携带的RNA在调节宿主天然免疫系统中的作用 在革兰氏阴性菌分泌的OMVs中发现了RNA从细菌细胞中表达，并被包装到OMVs中。经研究发现大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、牙龈假单胞菌和霍乱弧菌产生的OMVs中包含的细菌RNA对上皮细胞具有免疫刺激作用[26]。OMVs中所包含的RNA作为外源物质，其进入宿主细胞胞质后应该能够被胞质RNA感受器如RIG-I或MDA5所识别，激活宿主天然免疫反应，但目前相关研究还较少。

另有研究发现细菌细胞中的小RNA(small RNA，sRNAs)能够被包装至OMVs中，这些sRNA与miRNA大小类似，能够在铜绿假单胞菌分泌的OMVs中检测到其存在[27]。有趣的是，这些sRNA可以调节宿主基因的表达，从而调节宿主免疫反应[26]。这项研究中作者通过RNA-Seq来鉴定铜绿假单胞菌OMVs中差异包装的sRNA，并显示OMVs sRNA向宿主细胞转移。在OMVs中含量丰富的sRNA52320能抑制LPS和OMV诱导的人气道上皮细胞分泌IL-8。研究还发现sRNA52320能减轻OMVs诱导的KC细胞因子的分泌和小鼠肺内中性粒细胞的浸润。此外，在幽门螺杆菌OMVs中富集的sRNAs可以转移到人胃腺癌细胞中，并减少脂多糖或OMVs诱导的AGS细胞分泌IL-8[28]。OMVs还可以成功地将胞外sRNA输送到脑单核细胞或小胶质细胞中并引起神经炎症，这暗示了神经炎症疾病中的一种新的致病机制[29]。总之，这些发现证明经由OMVs介导的sRNA转移是一种新的宿主-病原体相互作用机制，在铜绿假单胞菌抑制宿主天然免疫过程中具有重要作用[27]。该研究不但能够拓展当前学术界对于细菌OMVs生理功能的认识，同时也为深入认识细菌-宿主相互作用方式提供新的思路。

3 OMVs的应用

革兰氏阴性菌OMVs被认为参与调节许多生理和病理过程。利用它们的生理特性，已经实现了向组织输送一系列治疗性物质(siRNA、microRNA和蛋白质)。OMVs具有被免疫细胞摄取的最佳大小，并且存在一系列天然构象的表面暴露抗原和Toll样受体(TLR)激活成分，因此它们在疫苗制备方面具有良好的潜力[30]。利用生物工程的方法设计有效的脂质体纳米载体来实现治疗药物的靶向性递送以及同源和异源抗原修饰，可以显著增强其免疫原性[31]。利用脂质双层拓扑结构，通过脂质体包裹两亲性治疗药物，除了增加它们的稳定性和减少副作用之外，还延长了药物半衰期[32]。与使用阿霉素相比，用脂质体包裹化疗药物阿霉素，可以最大限度地携带药物，研究显示其在肿瘤中的积累增加，而毒性显著降低。用脂质体包裹用作治疗结直肠癌的辅助化疗药物被认为是一种很有潜力的靶向药物输送系统[33]。OMVs可以是天然或工程的细胞保护因子或细胞毒因子的载体，并作为应用于从再生医学到靶向癌症治疗的一种新型治疗工具[34]。为了在特定条件下促进治疗药物的释放，需要在OMVs的研究基础上进行脂质体纳米载体的生物工程，以实现更好的靶向性和增加治疗药物的摄取。

OMVs作为一个复杂的球状物质，其包含有多种具有生物活性的大分子，这也提示研究者可以采用天然或者人工改造的OMVs作为基础来生产疫苗，以利于刺激产生复杂多样和更持久的保护性免疫反应。第一种临床许可的OMVs疫苗为防治B群脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidisserogroup B)的疫苗。百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)OMVs可以防止后续的致死性细菌感染，显著降低小鼠的细菌感染量[35]。OMVs包裹的体外miRNA在肿瘤微环境(TME)中对肿瘤细胞的耐药性和存活率起着至关重要的作用[36]。另有研究表明，应用与纳米颗粒结合的OMVs作为疫苗可以有效地预防小鼠感染耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌[37]。这种与纳米颗粒结合的方法可以产生更高水平的抗体，并且在预防致死性感染方面更有效，这是由于OMVs与纳米颗粒结合时具有更高稳定性，这也为今后OMVs疫苗的研发提供了新的思路。

4 展望

OMVs可以由多种致病菌和非致病菌产生。OMVs缺乏细菌细胞质组分，并且它们含有的生物大分子(蛋白质和脂质)水平显示出与它们来源的细菌OM拥有高度的相似性。OMVs作为细菌的一种分泌系统，其能够将内部包装的生物大分子递送至其定位到的不同宿主细胞。OMVs可以介导其产生细菌在游离态或生物膜结构中生存期间的分子释放，从而促进细菌维持毒力、释放压力、转化以及在不同宿主中的黏附与定植。此外，OMVs中存在酶降解机制，可以将复杂的物质分解成营养物质并运送到细胞中，因此OMVs在细菌的生存维持中发挥着重要作用。OMVs在细胞间传递分子的能力可以在各种生物过程中促进细胞间的交流。根据OMVs在营养获取、细胞间交流、调节细菌生态位、调节宿主天然免疫反应等过程中的多种多样的功能，我们不难发现OMVs在生理过程中的物质传递载体作用。因此，针对将OMVs作为药物传递载体的相关研究是近年来的一大热点。同时需要注意的是，在以OMVs为基础进行疫苗的制备过程中，需要仔细衡量免疫效果和潜在副作用之间的平衡。由于OMVs携带有大量的LPS，因此在大剂量注射的时候会诱发强烈的炎症反应。因此，需要对OMVs疫苗进行严格而彻底的安全性测试，以排除与OMVs相关的毒素可能带来的有害影响。