奶牛乳房炎源链球菌裂解噬菌体的分离鉴定

吴子文，王辉翔，张 琪，屈勇刚*，梁 晏，常军帅，易 鹏，俞佳辉，梁成哲

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

奶牛乳房炎严重影响奶牛业发展，据统计表明，全球约有2.2亿头奶牛，其中患乳房炎奶牛占总数的1/3，每年因各种类型的乳房炎造成的损失高达上百亿美元[1]。奶牛患乳房炎的主要原因是受到病原微生物的侵袭，150多种病原微生物可导致泌乳奶牛患乳房炎，其中链球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一[2-3]。目前，抗生素是治疗奶牛乳房炎常用的药物，由于人们过度使用或误用抗生素，导致细菌产生耐药性，还严重影响公共卫生安全，威胁人类健康[4]。贾文博等[5]对从15个奶牛场采集的300份乳房炎奶牛的乳样经药敏分析发现，所分离到的链球菌对氨基糖类药物的耐药性为100%，对四环素类药物的耐药性均超过90%。抗生素疗法副作用的逐渐凸显，已难以达到理想治疗效果[6]。所以急需寻找一种新型治疗方式，既能有效地防治奶牛乳房炎，又能解决现有抗生素药物带来的一些弊端与危害[7]。

噬菌体(phage)是一种侵袭细菌的病毒，通过内溶素抑制肽聚糖的合成或利用穿孔素-内溶素系统水解肽聚糖来完成杀死细菌的过程。研究发现，噬菌体可用于治疗各种抗生素耐药病原体引起的疾病，治愈率高达80%～95%[8]。肖峰[9]研究报道，金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15对金黄色葡萄球菌造成的小鼠乳房炎模型表现出良好的治疗效果。本研究以奶牛乳房炎源链球菌为宿主菌，从奶牛场的粪便和污水中分离得到一株裂解性肌尾噬菌体，采用双层琼脂平板法对其进行了生物学特性分析，以期为奶牛乳房炎的防治提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和样品的准备 实验室分离并保存的33株奶牛乳房炎源致病性链球菌为本次实验的宿主菌。采集石河子地区某奶牛场的粪便、奶牛生活用水和污水，将其充分混匀作为噬菌体的来源。

1.1.2 主要试剂 BHI培养基，青岛海博生物技术有限公司产品；DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease，康为世纪生物科技有限公司产品；病毒基因DNA/RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；SM缓冲液，叶源有限公司产品；PEG8000、20 g/L磷钨酸复染液，北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 透射电子显微镜(HT7700),日立(中国)有限公司产品；台式冷冻离心机(Multifuge X1R)，美国赛默飞世尔科技有限公司产品；电热恒温培养箱(DNP-9082)，上海精宏实验设备有限公司产品；立式恒温振荡器(IS-RDV1)，美国精骐有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离、筛选及纯化 将采集到的混合溶液经过8层纱布、双层滤纸和0.22 μm微孔滤膜逐次过滤。将所得滤液加入到BHI培养基中，并向其中加入33株链球菌的菌悬液各1 mL，在37℃、160 r/min条件下振荡培养5 h，将混合液在1 000 r/min离心10 min，取100 μL上清液分别加入到预先准备的33支试管中，再向每个试管中分别加入不同链球菌的菌悬液100 μL,充分混匀静置15 min，采用双层琼脂平板法培养12 h，观察生长情况。筛选出可以看到噬菌斑的平板，在该平板中取一个形态、大小相似的噬菌斑接种到相应的宿主菌培养液中，在37℃、160 r/min条件下振荡培养3 h。取10倍倍比稀释的噬菌体上清液与菌液混匀吸附15 min，采用双层琼脂平板法观察噬菌斑大小、形态，重复该步骤3次以上，直至平板上噬菌斑大小相近、形态一致。

1.2.2 噬菌体的浓缩及透射电子显微镜的观察 噬菌体的浓缩采取PEG沉淀法[10]，得到噬菌体浓缩液(噬菌体浓缩液的效价不低于1.0×1010PFU/mL)，取10 μL浓缩后的噬菌体液滴加在铜网上并作用15 min，多余的水分使用滤纸吸出，染色选用20 g/L磷钨酸作用30 min,等待干燥后,通过透射电子显微镜观察。

1.2.3 噬菌体的核酸类型鉴定 采用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取噬菌体基因，将提取的噬菌体核酸分别在RNase A、DNase I和Mung Bean Nuclease 作用下在37℃水浴中酶解2 h，通过7 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体核酸类型。

1.2.4 噬菌体的生物学特性

(1)噬菌体效价测定：将噬菌体溶液1000 r/min离心10 min，取上清液并采取10倍倍比法进行连续稀释，取每个梯度的稀释液100 μL向其中加入相应的宿主菌的菌悬液100 μL，采用双层琼脂平板法，计算噬菌斑的个数，重复3次，取平均值。噬菌体的滴度=平板上噬菌斑个数×稀释倍数×10。(注：选取平板上有30～300个噬菌斑的平板，且噬菌斑个数小于30、大于300均不采取)。

(2)最佳感染复数(MOI)测定：将噬菌体与宿主菌按照不同MOI(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100)比例混合，再加入等体积的BHI培养基，在37℃、160 r/min条件下振荡培养3 h，采用双层琼脂平板法测量噬菌体效价，噬菌体效价最高的MOI为最佳感染复数。

(3)一步生长曲线 ：参考文献[11]，加入宿主菌及噬菌体，按最佳MOI混合，在37℃、160 r/min的条件下摇床培养3 h，分别在5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210 min取样，采用双层琼脂平板法测定噬菌体效价，重复3次取平均值，绘制一步生长曲线。

(4)噬菌谱：噬菌体液与11株链球菌、11株大肠杆菌、11株金色葡萄菌的菌悬液分别1∶1混合均匀，吸附15 min，采用双层琼脂平板法判断噬菌体对其他菌株有无裂解能力。

1.2.5 噬菌体稳定性研究

(1) 酸碱度耐受性：调节液体培养基pH(pH=2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)后高压处理，取已知等体积的噬菌体，分别加入5 mL不同pH的液体培养基，37℃水浴1 h，采用双层琼脂平板法计算噬菌体的滴度。制作pH稳定性曲线。

(2)热稳定性：将噬菌体液放置于不同温度下(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)恒温水浴，每隔10 min取一次样，测定噬菌体效价，重复3次取平均值，制作热稳定性曲线。

2 结果

2.1 分离、纯化和效价测定结果

分离得到一株裂解性链球菌噬菌体，根据其来源命名为SM-P21。通过双层琼脂平板法对噬菌体进行3次以上的纯化处理，得到噬菌斑形状较为统一、大小近似相等、无色透明的噬菌体(图1)。纯化后的噬菌体经10倍倍比稀释通过双层琼脂平板法，计算噬菌斑个数，此步骤重复3次取平均值，计算得出噬菌体的效价9.4×109PFU/mL。

图1 噬菌体SM-P21的噬菌斑

2.2 噬菌体SM-P21的电镜观察

使用20 g/L磷钨酸复染纯化后的噬菌体浓缩液30 min，通过透射电子显微镜观察其形态(图2)，噬菌体属于肌尾噬菌体科，头部呈20面体，体长约203.11 nm，头长约48.7 nm×56.4 nm，尾长约为10.2 nm×89.66 nm。

图2 噬菌体SM-P21的电镜照片(80 000×)

2.3 噬菌体SM-P21核酸类型的鉴定

结果如图3所示。消化反应结果显示，噬菌体SM-P21的核酸被DNase I完全降解，不能被RNase A、Mung Bean Nuclease降解，由此可知噬菌体SM-P21的核酸类型为双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)。

M.DNA标准 DL 15 000; 1.SM-P21核酸; 2.RNase A; 3.DNase I;4.Mung Bean Nuclease

2.4 噬菌体SM-P21的最佳感染复数测定

按MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌，吸附15 min，采用双层琼脂培养法，观察平板上噬菌斑个数，此时噬菌体在侵染过程中释放的子代噬菌体的滴度最高，为9.45×109PFU/mL(图4)。

2.5 噬菌体SM-P21一步生长曲线测定

噬菌体的潜伏期约为15 min，暴发期约为95 min，经计算得出噬菌体的裂解量为249 PFU/cell左右(图5)。

2.6 噬菌体SM-P21裂解谱测定

结果见表1。通过对11株金色葡萄球菌、11株链球菌以及11株大肠埃希氏菌侵染情况的观察，目前得出噬菌体SM-P21对所选菌株并无裂解能力，噬菌体SM-P21只对宿主菌具备裂解能力。

图4 噬菌体SM-P21的最佳MOI测定

图5 噬菌体SM-P21的一步生长曲线

2.7 噬菌体SM-P21稳定性研究

2.7.1 热稳定性测定 测定噬菌体处于不同温度下的裂解情况。在温度越高、处理时间越长的情况下，噬菌体的侵染能力越来越弱直至消失。噬菌体的侵染能力在40.0℃～50.0℃之间基本保持稳定；温度到达55℃时噬菌体的活性逐渐降低；当温度到达60℃时，噬菌体滴度随时间延长大幅度下降直至为0(图6)。

2.7.2 酸碱度耐受性测定 由图7可知，pH在3.0～11.0之间，噬菌体的活性比较稳定，pH为7.0时，噬菌体的活性最高，说明该噬菌体对于pH的耐受性较强。但在强酸和强碱的情况下，噬菌体失去活性。

3 讨论

本试验采用双层琼脂平板法，从牛场中采集到的污水及粪便中分离纯化出一株裂解性链球菌肌尾噬菌体，根据噬菌体阶元的划分及噬菌体常规命名方法暂命名为SM-P21，其中S为Streptococcus(链球菌)，M为Myoviridae(肌尾噬菌体科)。根据国际病毒分类委员会(ICTV)的数据库，噬菌体SM-P21属于最为常见的dsDNA病毒群[12]。

表1 噬菌体SM-P21对33株临床分离株裂解情况

图6 噬菌体SM-P21的热稳定性

图7 噬菌体SM-P21的pH稳定性测定

噬菌体SM-P21与Bai Qinqin[13]报道的噬菌体JX01相比，吸附时间较长，JX01噬菌体90%以上完成吸附只需2.5 min，潜伏期为30 min，裂解量为20PFU/cell；而噬菌体SM-P21的吸附时间需要15min，潜伏期为15 min、暴发期为95 min，裂解量为249 PFU/cell左右，与噬菌体JX01相比，本试验所分离的噬菌体潜伏期较短，裂解量较大。噬菌体SM-P21与张倩[14]报道的噬菌体v B-Eco M-XJ2相比，噬菌体v B-Eco M-XJ2在40～60℃之间活性比较稳定，70℃时滴度大幅度下降直至为0，其温度耐受性较强于噬菌体SM-P21；噬菌体v B-Eco M-XJ2在pH 5.0～11.0之间侵染能力较稳定，比噬菌体SM-P21的酸碱耐受性弱。噬菌体SM-P21与柏琴琴[15]报道的3株牛源无乳链球菌LYGO9、HZ04和pA11相比，牛源无乳链球菌LYGO9、HZ04和pA11分别裂解42株牛源无乳链球菌的12株(28.6%)、13株(31%)、20株(47.6%)和23株 (54.8%)，其宿主范围广于噬菌体SM-P21。噬菌体SM-P21只对宿主菌有裂解能力，对本试验所选的33株临床分离菌并无裂解能力，针对SM-P21噬菌体是否有裂解其他菌株的能力，要在后期的试验中进行进一步的探索。

噬菌体是一类本身具有高度细菌特异性的病毒，具有高度的宿主特异性、复制能力、副作用极小以及无药物残留等优点，作为一种微生态制剂在治疗过程可以有效地避免药物残留和细菌耐药性问题[16]。Russell H等[17]在1969年首次分离得到牛源无乳链球菌噬菌体，并开展了对牛源无乳链球菌噬菌体及其相关试验研究。目前，国内针对奶牛乳房炎链球菌噬菌体的研究处于初步阶段，分离到的链球菌噬菌体相对较少，与已报道的奶牛乳房炎链球菌噬菌体相比，SM-P21具有较大的裂解量，对酸碱度和温度的耐受情况较好，具有潜在的应用价值。