防御素在雌性哺乳动物生殖系统中的分布和功能研究进展

苏美丽，肖越文，孔嵬潞，徐 可，田丽红*

(1.东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，黑龙江省哈尔滨市 150040；2.青海省饲草料技术推广站，青海省西宁市，810000)

防御素(defensin)是由脊椎动物、无脊椎动物和植物产生的抗菌肽，由6个～8个半胱氨酸残基组成。根据分子内二硫键的位置不同，将其分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3类。α-防御素存在于哺乳动物中，在Cys1-Cys6、Cys2-Cys4和Cys3-Cys5之间形成二硫键[1]。β-防御素广泛存在于脊椎动物中，二硫键于Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6之间形成，其中一些在N端形成α-螺旋[2-3]。θ-防御素在某些非人灵长类动物被鉴定出，有2个截短的α-防御素衍生的环状结构，二硫键在Cys1-Cys6、Cys2-Cys5和Cys3-Cys4之间[4]。研究表明，防御素除具有广泛的抗微生物感染及免疫调节功能外，还参与哺乳动物的有效生殖。近年来发现，防御素在哺乳动物雌性生殖系统中大量表达，并证实其具有促进卵母细胞和胚胎发育、成熟的作用，暗示防御素与雌性哺乳动物生殖功能密切相关。本文就防御素在哺乳动物雌性生殖系统中的种类、分布及其生物学功能作以综述，以期为研究抗生素替代剂及雌性哺乳动物有效生殖检测方法提供依据。

1 哺乳动物雌性生殖系统中防御素的种类及分布

最早在兔的肺泡巨噬细胞中发现的α-防御素，广泛存在于人、恒河猴的中性粒细胞和小肠潘氏细胞内[5]。近年来研究发现α-防御素在哺乳动物雌性生殖系统中表达。人类α-防御素5(human defensin,hD5)在正常阴道、外宫颈和炎症输卵管中表达量相同，但在正常宫颈、子宫内膜和输卵管中表达不同(分别为60 %、64 %和29 %)[6]。β-防御素大量存在于人和动物组织中，主要表达在各种器官的上皮细胞及黏膜表面，在哺乳动物的子宫、阴道、宫颈、输卵管等雌性生殖器官中广泛表达。在人体内，β-防御素1 (human beta-defensin,hBD1) 在宫颈、子宫内膜、输卵管和阴道处表达，hBD2在胎盘和绒毛膜滋养层有一定程度表达，hBD1-5在子宫内膜等多种上皮组织中广泛表达[7-8]。猪β-防御素(pig beta-defensin,pBD)的表达表现出品种差异性，pBD1基因在乌金猪和约大乌猪卵巢中表达量较高，pBD3基因在约大乌猪卵巢中表达量较高[9]。在雌性牛体内，β-防御素1(beta-defensin,BDEF1)在输卵管、乳头黏膜、阴道中均有表达[10]。在绵羊体内，只发现β-防御素1(sheep beta-defensin,sBD1)和β-防御素2(sBD2)的表达[11]，sBD1在雌性生殖道的各个组织均有表达，表达量从高到低依次是子宫颈、子宫和输卵管、阴道[12]。大鼠β-防御素1-4 (rat beta-defensin,rBD1-4) 在大鼠子宫内膜中表达，小鼠β-防御素1-4(mouse beta-defensin,mBD1-4)在子宫和阴道处表达[13]。骆驼β-防御素1 (camel deta-defensin,caBD1) 、β-防御素2 (caBD2) 和β-防御素7 (caBD7) 在子宫内膜中表达[14]。黑山羊β-防御素1(goat beta-defensin,gBD1)在卵巢、子宫和阴道中表达[15]。θ-防御素在雌性哺乳动物生殖系统中尚未发现具体表达。

2 哺乳动物雌性生殖系统中防御素的生物学功能

2.1 参与雌性生殖系统抗微生物感染

防御素在哺乳动物雌性生殖系统中表现出广谱抗菌功能，能直接杀灭或抑制侵入哺乳动物体内的病原微生物，同时发挥抗炎作用，参与雌性生殖系统组织内的免疫反应，从而预防子宫或生殖道等的感染，维持雌性生殖系统的环境稳定[16]。由淋球菌以外的病原体所致的非淋菌性宫颈炎是最常见的性传播疾病，hBD2和hBD3在非淋菌宫颈炎组织中表达水平明显增强，暗示 hBD2和hBD3的表达增强对宫颈上皮迅速杀灭入侵的病原菌意义重大[17]。链球菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性致病菌和大肠埃希氏菌、沙门氏菌、变形杆菌等革兰氏阴性致病菌是引起哺乳动物雌性生殖道炎症的重要病原菌[18-19]，研究表明哺乳动物生殖道内多种防御素对以上微生物表达出抗菌活性，发挥抗炎作用。例如，大肠埃希氏菌异源表达的pBD1和pBD2分别具有抗大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、单核增生李斯特菌、白色念珠菌活性[20]和抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌活性[21]；犬科β-防御素1-3 (canine beta-defensin,cBD1-3) 对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、淋球菌和大肠埃希氏菌均表现出较强的抗菌活性，但对白色念珠菌和解脲支原体抑制作用轻微[22]；sBD1对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌和痢疾杆菌等均有明显抑制作用[23]。在病毒感染中，HD5能够防止人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)进入宫颈角蛋白细胞，降低宫颈组织感染HPV的风险，并预防二次感染，影响适应性免疫[24]。HD5 在低离子强度和无血清条件下，低微摩尔浓度即可抑制原发性CD4+T淋巴细胞的艾滋病病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV-1)感染[25]。

但也有研究表明，某些防御素在动物体内的高表达在一定条件下会促进病毒的感染[26]。在宫颈阴道组织培养系统中，由淋病奈瑟菌感染诱导的HD5和HD6可经CD4和HIV独立于核心受体方式来增加艾滋病病毒感染率[27]， 属于人类α-防御素的人中性粒细胞防御素-1(human neutrophil defensin-1,HNP-1)也能够破坏上皮完整性，促进艾滋病病毒跨越上皮屏障，利于病毒的感染和传播[26]。

2.2 参与雌性生殖

卵泡发育依赖于卵泡壁颗粒细胞的增殖。将颗粒细胞与不同浓度pBD2或pBD3共培养24 h后发现，pBD3以浓度依赖性方式刺激颗粒细胞增殖，而任何浓度的pBD2均不能刺激颗粒细胞的增殖。细胞迁移试验显示，pBD3可使颗粒细胞迁移率提高2.5倍。pBD3还能显著提高磷酸化ERK1/2与非磷酸化的比率，而特异性ERK1/2磷酸化抑制剂U0126可显著抑制pBD3诱导的颗粒细胞的ERK1/2磷酸化及细胞增殖和迁移，表明在卵泡发育过程中，pBD3可通过ERK1/2途径增强小卵泡源性颗粒细胞的增殖和迁移来调节卵巢功能[28]。

在妊娠过程中防御素也具有重要作用。用ELISA法测定50对因不孕而接受辅助生殖技术治疗夫妇的卵泡液和精液中hBD1的浓度，发现卵母细胞受精率高的女性卵泡液中hBD1表达水平显著高于受精率低的女性，暗示卵泡内hBD1的表达水平与卵母细胞的受精率有关[29]。研究也发现hBD2在羊水中的浓度与膜的早破呈正相关，可在妊娠中期实施羊膜穿刺术，测定羊水中hBD2浓度并分析其表达水平，来预防早产膜破裂[30]。另外，在足月分娩或自发性早产妇女的羊水中，hBD3的浓度均会增加，表明hBD3参与羊膜腔对微生物或危险信号的宿主防御机制[31]。健康奶牛在产犊当日，子宫内膜中β-防御素4(BDEF-4)和β-防御素5(BDEF-5)高组成性表达，反映了它们在子宫内膜免疫和保持子宫健康的重要作用[32]。hBD1和hBD2被发现在人类初乳和成熟乳中，且在初乳中hBD1和hBD2浓度更高，初乳中的hBD1可在婴儿出生后6个月内预防上呼吸道感染。丰富的牛中性粒细胞β-防御素1(bovine neutrophil β-defensins1,BNBD1)和 BNBD-2也被发现在新鲜牛乳中[33]。

2.3 参与雌性生殖系统免疫调节

β-防御素是哺乳动物雌性生殖系统抵御外来病原体感染的第一道防线，在预防子宫或生殖道感染等方面起免疫调节作用。在绵羊输卵管上皮细胞中，LPS 通过 Toll 样受体 4(TLR4)激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)P38、ERK 和 JNK 信号通路上调 sBD-1 的表达，从而保护输卵管上皮免受外来病原体的感染[34]。hBD2在阴道黏膜的天然免疫中也发挥重要作用。受支原体和衣原体感染的小鼠，其阴道组织中mBD2的表达水平明显高于正常小鼠，通过检测分析小鼠阴道组织中mBD2表达水平可预测小鼠非淋菌性阴道炎的发生[35]。研究表明，宫颈阴道中hBD2低表达的妊娠妇女与表达正常的妊娠妇女相比，发生自然早产的几率略有升高[36]。hBD3和 hBD4在人类子宫内膜中表达呈周期依赖性，hBD3 mRNA 表达水平在月经周期的黄体期最高，而 HBD4 mRNA 表达水平在月经周期的卵泡期达到峰值。这些天然抗菌剂有助于人类子宫内膜中存在的先天免疫发挥作用，防止子宫感染[7]。而胎盘的合体滋养层产生包括 hBD1-3的多种抗菌分子，可能为母体血液中存在的任何感染提供关键的防御屏障[37]。

3 前景与展望

3.1 用于雌性哺乳动物有效生殖检测

防御素和雌性哺乳动物生殖过程密切相关，参与卵泡发育、受精、妊娠分娩等生殖各阶段及产后细菌感染预防。β-防御素可以保证卵母细胞的质量，保护卵母细胞免受微生物的侵害。研究表明，卵母细胞受精率良好(≥75%)的女性hBD1在卵泡液中的表达水平显著高于受精率不佳(<75%)的女性，提示hBD1具有潜在的促受精作用[29]。在妊娠中期实施羊膜穿刺术，通过检测分析羊水中hBD2表达水平即可预估胎膜早破的可能性[30]。而病原微生物等抗原刺激能够上调hBD2的表达，通过测定hBD2的表达水平可预测动物生殖系统的感染程度[38]。因此，防御素可作为哺乳动物生殖功能的检测指标，根据防御素表达水平的高低，可以了解卵巢功能、预防胎儿早产、推断子宫健康状况。

3.2 用于预防病原微生物感染

防御素是存在于动物体内的一种小分子内源性抗菌肽，具有广谱抗微生物活性，又不易诱发其产生抗性。防御素对生殖系统常见的病原体如细菌(部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)、病毒(HPV、HIV)以及支原体(解脲支原体)均表现出较强的杀伤作用，是生殖道黏膜抵御外来病原体感染的屏障，对维持雌性生殖系统内菌群平衡及保证成功妊娠发挥重要作用。包括hBD1-3在内的几种天然抗微生物制剂在妊娠子宫的宫颈、胎膜、胎盘等关键部位及胎脂中的大量表达，可防止子宫或胎儿在母体妊娠后期或分娩期间受到感染[37]。因此，防御素作为抗生素替代品，用于生殖系统病原微生物感染的预防和治疗具有广阔的应用前景。