中性粒细胞胞外诱捕网形成及其在肝脏炎症中作用的研究进展

支建博，杨茜雅，谢 磊，官艳东，董强

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100)

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是2004年首次报道发现的一种结构，具有免疫防御等作用。近年的研究发现，NETs与一系列疾病过程有关，包括自身免疫性疾病、血栓形成和寄生虫病[1-3]。研究发现机体形成的NETs可以对组织器官(如眼睛、肝脏和肾脏)的炎症造成影响甚至导致疾病的进一步恶化。其中肝脏炎症是影响动物和人类代谢功能和健康的一大类疾病，NETs一方面可预防炎症的发生、缓解炎症导致的损伤，另一方面也与炎症程度的加剧和组织的损伤有关。迄今为止，NETs对肝脏炎症影响的研究并不系统和深入。本文按非吞噬细胞氧化酶(NOX)依赖的方式和NOX非依赖的方式概述了NETs生成的机制，总结了NETs在肝脏感染性炎症、酒精性肝炎等不同炎症中作用的研究进展，以期为以NETs中相关分子作为肝脏炎症诊治靶点的研究提供依据。

1 NETs形成的机制

NETs形成过程中，中性粒细胞发生的有别于凋亡和坏死的死亡程序统称为NETosis。NETosis的机制主要分为2种，即非吞噬细胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase,NOX)家族中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶依赖的NETosis和NOX非依赖性的NETosis。炎症激动剂佛波脂(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以分别通过不同的机制诱导NOX依赖的NETs形成[4-5]。在PMA的刺激下，胞浆中Ca2+浓度升高，蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)被活化，使NOX的核心成分gp91phox/NOX2磷酸化激活NOX[6]。这一过程促进了NOX的组装，从而推动了活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生，ROS随后会分解中性粒细胞中的颗粒与核膜[7]。中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)通常包含在嗜天青颗粒中，受到ROS攻击后，从颗粒中逃逸出来移位到细胞核，降解组蛋白，并协同促进染色质的解凝。这一过程最终导致中性粒细胞膜完整性的丧失，去凝聚的脱氧核糖核苷酸(DNA)形成网状结构被释放到细胞外环境中。LPS诱导的NOX依赖的NETs形成是通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介导的一个单独途径实现的。JNK作为一种分子开关，可与中性粒细胞表面的Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)结合激活信号传导途径。LPS浓度增加时，JNK的磷酸化程度逐渐升高而被激活，激活后的JNK在NOX活化的过程中发挥了作用，从而进一步诱导ROS的产生，最终启动NETosis[8]。NOX非依赖性的NETosis的启动方式可由离子霉素等Ca2+载体激活来诱导。Ca2+载体可激活中性粒细胞的小电导钙离子激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channel 3,SK3通道)，诱导线粒体ROS的形成。线粒体ROS激活了NOX非依赖的NETs形成所特有的激酶，例如细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和JNK等。这些激酶激活转录因子，导致启动子区域的转录激活，这一过程使染色质解缩成为可能。该途径精氨酸脱亚氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PAD4)被线粒体ROS激活，致使大量的PAD4存在于胞浆中并在离子霉素作用下与Ca2+结合，再移位到中性粒细胞核。活化的PAD4将组蛋白中带有正电荷的精氨酸转化为瓜氨酸，导致正电荷丢失，破坏DNA和组蛋白之间的静电作用，并使染色质解聚。NE和MPO等酶进入细胞核后，可修饰染色质并使核膜降解，促进网状结构的形成。蛋白Gasdermin D可使细胞膜形成孔隙，使NETs得以释放[9-10]。

2 NETs在肝脏感染性炎症中的作用

肝脏感染性炎症由多种病原微生物感染引起，包括细菌、真菌、病毒以及寄生虫等。在发生感染后，组织内的巨噬细胞和其他前哨细胞会分泌炎性细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化物质能够招募和激活中性粒细胞。中性粒细胞作为最早到达感染部位的效应细胞之一，在病原体清除、募集等方面发挥关键作用[11]。中性粒细胞采用3种主要策略来对抗微生物，即吞噬、脱颗粒和释放NETs[12-14]NETs是由去凝集的染色质与30多种不同的中性粒细胞蛋白组成的网状结构。感染性因素引起的炎症与血浆中组蛋白的出现有关，NETs包含所有类型的组蛋白，并以浓度依赖的方式引起细胞毒性。NETs的另一组分MPO的活性也可以引起邻近组织的损伤[5]。此外，NETs的形成还会引起巨噬细胞浸润，并分泌炎性细胞因子白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor,TNF-α)，导致炎症加剧[15]。

2.1 NETs在细菌感染中的形成和作用

金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌是两种引起肝脏感染最主要的病原菌。它们刺激中性粒细胞后，细胞会产生含有去凝集的染色质和颗粒抗菌蛋白的囊泡，形成NETs并释放到胞外空间。已知TLR和补体是关键的先天防御系统成分，在细菌感染后迅速被触发。有证据表明，补体和TLR信号通路之间通过相互作用增强先天免疫[16]。NETs的形成过程依赖于TLR2和补体因子3(complement 3,C3)，因为在缺乏TLR和C3时，中性粒细胞无法释放NETs的关键组分组蛋白与核DNA[17]。NETs重要组分组蛋白和NE等不但具有杀菌和抗菌特性[18]，还可以形成一道物理屏障，防止病原菌的传播[19]。髓系相关蛋白14是一种中性粒细胞胞浆蛋白，它与NETs一起排出并发挥抗菌作用[20]。

2.2 NETs在寄生虫感染时的形成和作用

肝脏组织内的寄生虫主要有华支睾吸虫、肝片形吸虫和肝毛细线虫等。有研究证明，巨型肝片吸虫幼虫(excysted juveniles ofFasciolagigantica)能够诱导水牛中性粒细胞形成NETs。而形成的网状结构能够诱捕这种吸虫，但不影响其存活率和完整性。研究结果提示，NETs的形成很可能通过阻碍大型幼虫的迁移，以促进免疫细胞对它们的杀灭[21]。

2.3 NETs在真菌感染中的形成和作用

念珠菌病在肝脏真菌感染中的发病率最高。最常见病原为白色念珠菌，一种真核病原体，能够激活中性粒细胞。该细胞通过C型凝集素受体Dectin-1识别真菌的大小，若过大无法通过吞噬作用清除，则通过识别真菌成分，如β-葡聚糖、纯化的天冬氨酸蛋白酶等促进NETs形成的因子，诱导NETs形成。然而，其他分子，如真菌磷脂酶可激活PKC，而PKC的激活是诱导NETs形成的原始步骤，也能够使中性粒细胞中DNA释放，促进NETs的生成[22]。NETs特有的网状纤维结构可杀死念珠菌，纤维中的颗粒蛋白包含乳铁蛋白(lactoferrin,LF)和MPO，能有效杀灭白色念珠菌菌丝和酵母菌。此外，NETs中的组蛋白具有阳离子性质，在促进真菌病原体与NETs的结合方面发挥重要作用[23]。

2.4 NETs在病毒感染中的形成与作用

乙型肝炎病毒(HBV)作为肝脏最主要的病毒性感染源之一，可引起多种肝病。NETs作为重要的免疫防御机制可能参与了乙型肝炎病毒(HBV)的持续性感染。研究表明，在经病毒内含有的HBVc或HBVe蛋白处理的细胞中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和ERK1/2的磷酸化水平显著降低，使ERK和p38MAPK通路参与的ROS产生被抑制；其次，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活性被增强，可通过负性调节与自噬机制相关的蛋白质来抑制自噬的启动。已知自噬能够通过多种机制参与NETs的形成，所以HBV主要是以这两种方式来抑制NETs释放[24]。HBV感染后中性粒细胞和血小板重新聚集到肝血管系统，通过促进NETs释放来保护宿主细胞免受病毒的感染，结果表明NETs 在预防病毒感染方面具有重要的作用，但具体机制需进一步探究[25]。

3 NETs在酒精性肝炎中的形成和作用

酒精性肝炎时，酒精的快速摄入会促进中性粒细胞在肝脏中的显著渗透，并导致中性粒细胞免疫失衡，从而诱导NETs的释放。研究发现，NETs的形成依赖于病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)中的LPS和损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPS) 中的高迁移率族蛋白B1，它们可以激活中性粒细胞，导致NETs的释放。CXC趋化因子配体(CXC chemokine ligand,CXCL)，如CXCL1和CXCL2等对中性粒细胞募集和维持中性粒细胞的正常功能至关重要。重组CXCL1可改善中性粒细胞募集，并促进NETs形成[26]。酒精的作用可显著抑制LPS诱导的肝脏中高迁移率族蛋白B1升高，从而使中性粒细胞NETs的形成减少，可能导致其抗菌能力减弱。同时，也可使巨噬细胞对NETs的清除作用减弱， NETs大量积累并产生细胞毒性作用。原因是由于其成分组蛋白带有正电荷，易于与带有负电荷的磷脂细胞膜结合，造成细胞膜的导电性增高，并导致Ca2+内流，引起膜损伤[27]。组蛋白也可作用于TLR，通过其介导的信号通路，活化炎性细胞与免疫细胞，引起炎症反应和诱导免疫应答，最后导致肝脏炎症的加剧和组织损伤[28]。

4 NETs在非酒精性脂肪肝病中的形成和作用

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)引起的肝损伤的表现为肝细胞损伤、细胞死亡以及纤维化。非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)作为NAFLD的一类，其发病机制复杂，受营养、遗传、代谢和炎症因素的影响[29]。目前研究已具体到一些相关外周代谢信号的调控作用。研究表明，用蛋氨酸缺乏性高脂饲料处理小鼠，来诱导早期脂肪肝损伤的发生时，作者提出，鞘氨醇1-磷酸(S1P)是细胞膜鞘磷脂代谢的产物，通过其受体(S1PRs)诱导多种细胞的浸润和激活，调节重要的生理和病理活动。其机制是在SIPR2介导下，由SIP诱导的、通过依赖ERK、p38MAPK、ROS等信号通路将中性粒细胞的凋亡重新定向至NETosis。据报道，NETs能刺激枯否氏细胞表达炎性细胞因子和趋化因子来引起肝脏损伤，该研究的结果揭示SIPR2基因的敲除通过减少NETs的形成来显著降低炎性细胞因子的产生，谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)的水平以及组织学上的炎症和纤维化程度[30]。此外，非酯化脂肪酸(NEFAs)、油酸(OA)和亚油酸(LA)通过Pannexin1和P2X1的激活来诱导ATP的释放和NETs的形成[31]。在 MPO 缺失的非酒精性肝炎小鼠中，肝细胞的纤维化和损伤程度显著下降，缓解了NASH的进程[32]。此外，通过抑制 NE 基因的表达可降低NASH小鼠肝脏脂肪变性，并减缓炎症加剧。上述试验结果表明，NETs通过 MPO和NE 在NASH 中发挥对肝脏的损伤作用。研究也为通过抑制NETs的生成来治疗NASH提供了试验和理论基础[33-34]。

5 NETs在自身免疫性肝炎中的形成和作用

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是一种急性或慢性肝实质疾病，其特征是对肝细胞特异性自身抗原缺乏耐受性。可根据抗核抗体(antinuclear antibody，ANA) 和抗平滑肌抗体将 AIH分为1型AIH(ANA和/或抗平滑肌抗体阳性)和 2 型 AIH(肝-肾微粒体1型抗体或肝细胞溶胶1型抗体阳性)两类[35]。虽然AIH中产生ANA的机制尚不明确，但AIH中的抗DNA、抗组蛋白、抗着丝粒、抗染色质、抗核糖核蛋白和抗细胞周期蛋白A抗体参与了ANA反应，而染色质、组蛋白和 DNA 均为 NETs 的成分，提示ANA与 NETs 形成有关[36]。AIH的病因以及该过程中NETs产生的机制尚不清楚，但在炎症的早期中性粒细胞的浸润以及与NETs组分对应的蛋白抗体提示NETs的确参与了该类炎症的过程。

6 结语

本文综述了NETs在几种肝脏炎症中的形成机制与作用，其成分具有良好的杀灭病原微生物的能力，对肝脏炎症具有重要作用，但过度的NETs形成具有促炎特性。在动物模型中，抑制NETs形成在大多数无菌损伤的情况下是有益的，而在感染性炎症中NETs的形成也不是完全有利的。需要进一步明确其形成的分子机制及涉及的各类信号途径、深入评估NETs的生成在各类肝脏炎症中的利弊，为利用NETs在炎症中表现出的优势和开发特异性的药物提供理论依据。