供体来源细胞游离DNA在肾移植中的研究

孙 欣 张 涛 综述 唐 亮 审校

肾移植是治疗终末期肾病的首选方法。移植肾功能损伤主要与排斥反应、免疫抑制药物毒副作用及移植物肾病有关。血清肌酐、尿素氮、肌酐清除率、尿蛋白等实验室监测指标常用于反映监测移植肾损伤,但存在一定滞后性[1],在发生明显肾损伤时才会发生变化,难以作为早期精准诊断及评估预后的标准。移植肾活检是鉴定移植肾损伤病因的“金标准”,其有创性可能造成出血及移植器官损伤等并发症,同时病理报告的延时性及活检部位差异可能导致的结果不确定性也为移植肾损伤临床早期诊断及治疗带来不少困难[2]。因此,寻找能够无创、早期且准确诊断移植肾损伤的生物标志物,不仅能对疾病进行早期干预,还可对诊疗措施进行客观评判,正逐渐成为当今肾移植领域研究的热点。研究表明供体来源细胞游离DNA(donor-derived cell-free DNA,dd-cfDNA)在监测移植肾损伤,尤其是在监测移植肾排斥反应方面有重要意义[2]。dd-cfDNA是一种源于供体的碎片化、可降解DNA片段,是一种监测移植物损伤的新型、无创生物标志物。本文着重就dd-cfDNA在肾移植的应用价值作一综述。

细胞游离DNA(cell-free DNA,cf-DNA)

cf-DNA在1948年由法国科学家Mandel和 Metais发现。血浆中cf-DNA约90%来源于白细胞,肾脏、肝脏等器官也少量生成。细胞核中DNA缠绕组蛋白形成核小体,当细胞凋亡、坏死时,核小体释放入血,被多种核酸酶剪切形成cf-DNA。坏死产生的cf-DNA片段大,约10 000个碱基对,而凋亡产生的cf-DNA片段小,约170个碱基对。cf-DNA半衰期为30～120 min,其清除机制尚未完全阐明,核酸酶剪切、肾脏代谢及肝脏和脾脏摄取都可能参与[1]。多种因素影响cf-DNA水平,如肥胖、运动、炎症及肿瘤等[3-6]。肥胖会破坏脂肪细胞肥大和增殖之间的平衡,导致脂肪细胞缺氧、炎症、凋亡和坏死,进而加速脂肪细胞分泌cf-DNA[3]。运动可提高体内cf-DNA水平,且cf-DNA上升幅度与运动的强度及持续时间有关,具体机制不清,可能涉及压力因素、细胞坏死及凋亡[4]。脓毒症和危重感染患者血液中cf-DNA水平升高。 通过整合微生物和机体信息,cf-DNA有望成为脓毒症的生物标志物,有助于临床决策[5]。肿瘤细胞坏死或凋亡时产生cf-DNA,又称为循环肿瘤DNA,可用于发现早期肿瘤,监测肿瘤的进展及复发[6]。

供体来源细胞游离DNA(dd-cfDNA)

cf-DNA包含多种类型,最主要的有dd-cfDNA,循环线粒体DNA,循环肿瘤DNA,循环胎儿DNA。1998年,Lo等[7]发现接受男性供体的女性肾及肝移植受者血浆中存在供体特异性cf-DNA,由此开启了dd-cfDNA相关研究。dd-cfDNA是在受者血、尿中检测到的外源性且由移植器官分泌的cf-DNA,只占cf-DNA总量的小部分。dd-cfDNA定量标准有dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA绝对值,其中dd-cfDNA(%)是指dd-cfDNA占受者总cf-DNA的百分比。器官移植初期,受者体内dd-cfDNA上升,而后逐步下降至“稳定”水平。当出现移植器官排斥、缺血再灌注损伤或感染时,受者体内dd-cfDNA会迅速升高(图1)。

图1 dd-cfDNA在移植肾排斥、缺血再灌注损伤、移植肾感染后水平上升,或是移植肾损伤监测的早期生物标志物dd-cfDNA:供体来源细胞游离DNA;可能机制为:同种异体肾移植后,如出现移植肾排斥反应、缺血再灌注损伤或移植肾感染,可导致移植肾损伤,促进移植物细胞坏死、凋亡,进而释放到循环中的dd-cfDNA数量明显增多。后期移植肾损伤进展引起肌酐等升高、尿蛋白阳性,最终造成移植肾失功

dd-cfDNA在肾移植中的应用

监测移植后排斥反应dd-cfDNA可检测移植后排斥反应,对鉴别抗体介导排斥反应(ABMR)和T细胞介导排斥反应(TCMR)有辅助诊断价值[8]。dd-cfDNA是肾移植的预后标志物和风险分层工具,持续低水平dd-cfDNA或能准确识别同种异体移植物免疫耐受[9]。排斥反应治疗后引起dd-cfDNA变化,持续高水平dd-cfDNA可能提示排斥反应尚未完全恢复[10]。ABMR组受者dd-cfDNA(%)明显高于对照组(2.4%vs0.65%,P<0.001),阈值1%时,敏感性88.9%,特异性73.7%,阳性预测值(PPV)76.2%,阴性预测值(NPV)87.5%[11]。ABMR组受者dd-cfDNA(%)和dd-cfDNA绝对值较TCMR组显著升高。dd-cfDNA(%)鉴别诊断TCMR和ABMR的曲线下面积(area under the curve,AUC)阈值、敏感性、特异性分别为0.76、1.11%、88.89%、59.52%，而dd-cfDNA绝对值鉴别诊断TCMR和ABMR的AUC、阈值、敏感性、特异性分别为0.74、0.53 ng/mL、88.89%、54.76%[8]。dd-cfDNA能有效鉴别ABMR而非TCMR,且dd-cfDNA(%)高并不代表一定有排斥反应。一项回顾性研究纳入63例受者行移植肾活检,共34例急性排斥反应(acute rejection,AR)。ABMR,TCMR,活检阴性组dd-cfDNA(%)分别为1.35%,0.27%,0.38%。29例活检阴性受者中有8例dd-cfDNA(%)>1%[12]。Halloran等[13]研究表明,dd-cfDNA水平反映排斥反应活跃程度,如水平低,代表排斥反应发生概率低,可减少不必要的移植肾活检。dd-cfDNA(%)与ABMR相关性最强,与活跃TCMR有关,与不活跃TCMR、肾损伤和萎缩性纤维化无关。DART研究表明,dd-cfDNA能辨别发生排斥反应的移植肾活检标本;dd-cfDNA(%)阈值1%时,排斥反应的PPV、NPV分别为61%、84%，而ABMA的PPV、NPV分别为44%、96%;dd-cfDNA(%)鉴别ABMR与非ABMR活检标本的AUC为0.87;ABMR,TCMR≥IB型,TCMR IA型,对照组的dd-cfDNA(%)中位值分别为2.9%,1.2%,0.2%,0.3%[14]。荟萃分析表明,dd-cfDNA水平在TCMR受者与“稳定”受者无差异。dd-cfDNA可能是ABMR而非TCMR的生物标志物[15-16]。

供体特异性抗体(DSA)是引发同种异体移植排斥反应的重要原因。高水平dd-cfDNA可促进新生DSA(dnDSA)形成[1]。dd-cfDNA和dnDSA与ABMR密切相关,DSA平均荧光强度(MFI)≥2 500与C4d染色评分、dd-cfDNA>1%与微血管炎症的关联最强[17]。Cheng等[18]研究表明,dd-cfDNA优于DSA,是ABMR特异性指标。DSA-MFI能加强dd-cfDNA检测效能。dd-cfDNA或是鉴别DSA阳性受者ABMR和其他类型损伤的有效手段。ADMIRAL研究发现dd-cfDNA(%)比DSA提前91 d升高[9]。受者dd-cfDNA(%)≥0.5%时,dnDSA形成风险提高3倍。受者有两份或以上dd-cfDNA(%)结果>0.5%可预测3年内估算的肾小球滤过率(eGFR)下降超过25%。dd-cfDNA(%)≥0.5%与临床和亚临床排斥反应密切相关[9]。dnDSA阳性受者的dd-cfDNA(%)更高。dd-cfDNA(%)异常升高与dnDSA、eGFR下降相关。术后第1年dd-cfDNA(%)≥1%和dd-cfDNA(%)增幅≥0.34%与第2年eGFR下降≥25%有关[19]。

一项多中心队列研究首次报告肾移植受者dd-cfDNA的临床实践经验,指出dd-cfDNA有助于临床决策。dd-cfDNA(%)预测排斥反应准确率为64%[20]。QIDNEY研究从侧面证明了dd-cfDNA影响临床决策。该研究纳入美国175名执业肾病专科医生,通过模拟病例资料中有无dd-cfDNA数据进行2轮测试。结果表明,模拟病例引入dd-cfDNA数据后,医生能及时发现早期和亚临床排斥反应,做出正确处理措施,并适当修改治疗方案[21]。

排斥反应是儿童肾移植术后常见且难治的并发症,导致儿童移植肾丢失率高,亟需新型监测手段。dd-cfDNA(%)是识别儿童受者临床和亚临床排斥反应有用且可靠的指标。dd-cfDNA(%)>1%时,诊断排斥反应的敏感度86%,特异度100%,AUC 0.996[23]。dd-cfDNA或是TCMR治疗后可靠的随访指标。儿童受者排斥反应经积极治疗后dd-cfDNA下降,TCMR组<1.0%,下降最明显[22]。

监测免疫抑制不足受者感染细菌、病毒后需要下调免疫抑制药物剂量,加之一部分受者服药依从性差,导致排斥反应发生率升高。持续的免疫抑制不足诱导dnDSA形成,加剧移植物丢失风险[23]。在监测免疫抑制不足引起的亚临床移植物损伤中,dd-cfDNA或优于他克莫司血药浓度监测[1]。肾移植受者dd-cfDNA(%)升高与他克莫司浓度下降有关。dd-cfDNA与他克莫司相互作用机制未明,有如下假设:移植初期,他克莫司破坏白细胞稳定性,加速白细胞凋亡、溶解,导致血浆总cf-DNA增加。后期他克莫司剂量减少,白细胞数量增加,凋亡减少,存活时间延长,受者自身cf-DNA和总cf-DNA均减少,dd-cfDNA(%)增加[24]。

监测移植肾感染性疾病受者感染细菌、病毒时dd-cfDNA作用有待商榷。尿液dd-cfDNA浓度在BK肾病受者中明显升高,可鉴别BK肾病[2]。而Sigdel等[24]指出,尿液dd-cfDNA浓度无法辨别AR和BK肾病。尿路感染或BK病毒感染时,血浆dd-cfDNA(%)升高[25]。受者罹患BK肾病、BK病毒感染、巨细胞病毒感染或尿路感染时,dd-cfDNA(%)未明显改变[26]。移植肾发生肾盂肾炎和肾小管坏死时,dd-cfDNA(%)升高[26-27]。肾小球炎及管周毛细血管炎时,血浆dd-cfDNA(%)升高,而尿液dd-cfDNA(%)与肾小管炎有关[1]。dd-cfDNA绝对值与肾间质炎症、肾小球炎及管周毛细血管炎的病理Banff评分呈正相关[27]。

dd-cfDNA在其他器官移植中应用

目前单纯胰腺移植中尚无有关dd-cfDNA的研究报道。在胰肾联合移植(SPK)中,dd-cfDNA或能监测排斥反应。dd-cfDNA绝对值阈值为70 cp/mL时,诊断排斥反应的敏感度85.7%,特异度93.7%,AUC 0.89,比脂肪酶(AUC 0.74)和淀粉酶(AUC 0.46)更精确,但需移植45 d之后才能有效辨别胰腺移植物AR[28]。97%“稳定”SPK受者dd-cfDNA(%)<0.5%。dd-cfDNA(%)可鉴别SPK受体中AR与移植物损伤(胰腺炎)及免疫耐受[29]。肝移植受者因移植物体积大,肝细胞再生率较高,dd-cfDNA基线水平相对较高。dd-cfDNA是肝移植受者早期移植物损伤的敏感标志物。当肝移植物损伤时,dd-cfDNA(%)早于肝功能指标提前发生变化。阈值5.3%时,dd-cfDNA(%)鉴别AR的AUC、PPV、NPV分别为 0.95、87%、100%[30]。单肺移植和双肺移植中dd-cfDNA基线水平存在差异。dd-cfDNA是肺移植后AR的生物标志物。发生AR后,dd-cfDNA水平迅速升高,dd-cfDNA(%)中位数是1.95%。阈值>1%时,dd-cfDNA(%)诊断AR的敏感度、特异度、PPV、NPV、AUC分别为 77%、84%、60%、90%、0.89[31]。dd-cfDNA与心脏移植排斥反应显著相关,与“稳定”受者相比,AR受者dd-cfDNA(%)明显升高(0.38%vs. 0.03%,P<0.001)。dd-cfDNA水平与排斥反应的严重程度相关。阈值为0.25%时,dd-cfDNA(%)诊断AR的敏感度、特异度、NPV、AUC分别为81%、85%、99.2%、0.92[32]。

dd-cfDNA研究的不足

dd-cfDNA在肾移植中有广泛的应用前景,但目前研究仍有不足:(1)检测手段有待优化统一。不同dd-cfDNA检测平台差异大,测量变异度高,无法互认结果,有假阳性可能。(2)监测方案有待优化统一。目前尚无明确的dd-cfDNA监测方案。Pai等[33]依据肾移植后免疫治疗时间节点,阐明术后第1年第1月、2月、3月、4月、6月、9月、12月及第1年后每季度监测dd-cfDNA的临床工作原理。KOAR研究(NCT033226076,ClincalTrials.gov)计划在预定时间点行dd-cfDNA 监测及移植肾活检,有望解决此难题[1]。(3)定量标准有待优化统一。dd-cfDNA绝对值和dd-cfDNA(%)的优劣性尚有争议,需进一步研究优化定量标准。(4)缺少特异性免疫抑制药物研究:他克莫司(NCT04225988,ClincalTrials.gov)及托珠单抗(NCT03859388,ClincalTrials.gov)与dd-cfDNA的临床试验正在开展[34]。(5)缺少与其他指标如免疫激活标志物GEP、肌酐、DSA、趋化因子CXCL9及CXCL10的联合应用的研究,以期探索最佳监测手段[1,35]。

小结:dd-cfDNA作为一种新型、无创、灵敏度高、可重复性强的新型生物标志物,有助于早期监测移植肾排斥反应、免疫抑制不足及移植肾感染性疾病,有利于受者精准化治疗随访,预防移植肾过早丢失。尽管当前相关研究存在一定不足,限制其临床应用,但相信随着临床理论研究的深入开展,dd-cfDNA或将会改变肾移植临床实践,开启肾移植领域新的纪元。