宏基因组二代测序对肾脏重症监护病房免疫功能低下患者感染的诊断价值

李 喆 蒋 静 王 杨 周玉超 余 乐 娄丽璇 许书添 李世军

慢性肾脏病(CKD)患者常需要接受免疫抑制剂治疗[1],可能导致机体物理屏障、特异性及非特异性免疫系统受损,对各类病原体的易感性增加[2],严重影响预后,其中感染已成为狼疮性肾炎(LN)患者的首要死因[3]。

目前,常用的病原体检测方法均存在一定的缺陷[4]。宏基因组二代测序(mNGS)可直接从样本中提取全部微生物的核酸进行高通量测序,快速客观地检测病原体,与常规微生物学检测(CMT)相比,mNGS无偏倚、广覆盖、无需先证[5]。自2014年首次帮助1例严重联合免疫缺陷症少年确诊钩端螺旋体性脑炎以来[6],在不明原因发热[7]、脓毒症[8]、器官及干细胞移植[9]等患者的血液、脑脊液、痰及肺泡灌洗液(BALF)等标本中均展现了良好的检测效率。目前尚无mNGS在CKD感染患者的临床应用研究,本研究回顾性分析肾脏重症监护病房(ICU)收治的疑诊感染患者,与CMT对比,评估mNGS检测能力,探索mNGS在CKD免疫抑制患者感染鉴别诊断中的应用价值。

对象和方法

研究对象回顾性分析2018年8月至2022年4月国家肾脏疾病临床医学研究中心ICU收治的疑诊感染,院外抗感染疗效不佳的CKD免疫功能低下患者。疑诊感染依据:(1)持续腋下体温≥37.3℃;(2)有咳嗽、咳痰、胸闷、乏力、皮肤红肿、腹痛、腹泻、头痛、尿急、尿痛等感染临床症状;(3)C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)等炎症指标升高;(4)胸片、CT、心脏超声等影像学检查存在疑似感染灶。免疫抑制依据:(1)CD4+T细胞计数<200个/μL;(2)肾或造血干细胞移植;(3)感染前泼尼松20 mg/d治疗>14 d,或泼尼松累积剂量>600 mg;(4)接受其他免疫抑制剂治疗[10]。所有患者在接受抗感染药物治疗前根据临床需求,接受CMT检测(包括血、痰、BALF、鼻咽拭子、穿刺液培养,微生物学抗原抗体,细菌、真菌、病毒相关生物标志物等),无菌原则下采集送检样本,培养和mNGS标本同时送检。

排除标准:(1)入院3天内死亡或放弃治疗,CMT结果不完整;(2)入院时已明确感染病原体,抗感染明显起效;(3)抗感染后复查的mNGS结果;(4)不明原因发热,在院期间未找到明确发热原因。符合上述标准的患者分别为CMT确认感染组、临床诊断感染组和排除感染组进一步分析。本研究经东部战区总医院伦理委员会批准(批准文号2022DZKY-033-01)。

统计学方法使用《SPSS 26.0》软件进行数据分析,本研究计量资料均为偏态分布,以中位数(四分位间距)表示。三组间数据比较采用Kruskal-Wallis H检验,发现三组间存在差异时,采用Bonferroni法校正后再进行组间两两比较。计数资料以百分比表示,组间比较用χ2检验或者Fisher精确检验。所有检验均为双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般资料共纳入303例患者,男性186例(61.39%),中位年龄49(34,60)岁。原发疾病包括肾移植术后72例,LN 56例,膜性肾病34例,慢性肾功能不全33例,抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关肾炎和肾病综合征各20例,IgA肾病13例,足细胞病11例,冷球蛋白血症性肾小球肾炎8例,肾淀粉样变性、糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化症、抗肾小球基膜(GBM)肾炎各5例,具有肾脏意义的单克隆球蛋白病、常染色体显性遗传多囊肾病各3例,POEMS综合征、IgM肾病、过敏性紫癜性肾炎、干燥综合征肾损害各2例,多发性骨髓瘤肾损害、膜增生性肾小球肾炎各1例。35例合并2型糖尿病、22例合并类固醇性糖尿病。CKD起病至本次入院前,累计使用2 (1,3)种免疫抑制剂,中位治疗时间7 (2,50)月。入院前2月48例患者曾接受大剂量免疫抑制剂(如甲泼尼龙、环磷酰胺、利妥昔单抗)冲击治疗,253例服用泼尼松,中位剂量20(5, 30)mg/d。

51例(16.83%)患者符合《脓毒症3.0诊断标准》[11],感染部位包括肺部221例、皮肤25例、腹腔24例、胸腔18例、血流16例、尿路13例、胃肠道9例、颅内5例、感染性心内膜炎及结核性心包炎各1例。62例(20.46%)患者在院期间死亡。

三组临床资料比较165例通过CMT找到感染病原体为CMT确诊感染组;104例临床考虑感染,但CMT未找到感染病原体为临床诊断感染组;34例入院初期疑诊感染,后找到其他非感染发热原因为排除感染组(图1)。三组患者免疫抑制剂使用时间、累计免疫抑制剂总数、近2月泼尼松比例和剂量、入院体温、总淋巴细胞计数、CD4+T细胞计数、IgG、CRP、在院死亡率组间存在明显差异,其中排除感染组的免疫抑制剂使用时间、累计免疫抑制剂总数、入院体温、在院死亡率均低于CMT确诊感染组,而总淋巴细胞计数和IgG均高于CMT确诊感染组(P<0.05)(表1)。

图1 患者筛选流程mNGS:宏基因组二代测序;CMT:常规微生物学检测

表1 3组患者临床资料比较

CMT:常规微生物学检测;ICU:重症监护室;WBC:白细胞;PLT:血小板;TLC:总淋巴细胞计数;TNC:总中性粒细胞计数;IgG:免疫球蛋白G;PCT:降钙素原;CRP:C反应蛋白;P:三组间比较;P1:CMT确诊感染组与临床诊断感染组比较;P2:临床诊断感染组与排除感染组比较;P3:CMT确诊感染组与排除感染组比较

mNGS与CMT检测结果165例CMT确诊感染组中64例mNGS与CMT结果完全一致,46例部分一致,55例不一致。104例临床诊断感染组中60例可通过mNGS发现感染病原体。两组感染患者共86例根据mNGS结果调整抗生素治疗。34例排除感染组有29例CMT和mNGS双阴性,其中合并弥漫性肺泡出血、自身免疫性溶血性贫血、嗜血细胞综合征、可逆性后部脑白质病变各3例,血栓性血小板减少性紫癜2例,骨髓增生异常综合征、药物超敏综合征、抗磷脂抗体综合征、格林巴利综合征、间质性肺病各1例(图2)。

图2 mNGS与CMT总体分布对比mNGS:宏基因组二代测序;CMT:常规微生物学检测;(+):阳性;(-):阴性

本研究303例患者mNGS结果中,无病原体50例,真菌121例,革兰阳性菌54例、革兰阴性菌86例。2例在脑脊液中分别发现人疱疹病毒1型和JC多瘤病毒,确诊为单纯疱疹病毒性脑炎和可逆性胼胝体压部综合征。mNGS与培养在不同病原体检测分布见图3,其中85例肺孢子菌属、23例曲霉属、9例军团菌属、8例酵母属、6例罗氏菌属、4例链格孢属,以及10例结核分支杆菌、7例非结核分支杆菌、1例鹦鹉热衣原体仅能通过mNGS鉴定。

图3 mNGS与培养在不同病原体检测分布对比mNGS:宏基因组二代测序;(+)阳性;(-):阴性

mNGS与培养的检测一致性本研究患者血液、BALF、深部痰液、浆膜腔积液、脑脊液等标本mNGS与培养的细菌、真菌一致性检验,Kappa值分别为0.043、0.158、0.055、0.051、0.615,一致性分别为47.53%、62.50%、40.0%、33.33%、90.0%。与培养相比mNGS报阳时间更早,检测细菌、真菌种类更多(P<0.05)(表2),2种以上的细菌及真菌混合感染检出率,mNGS高于培养(24.42%vs3.30%，P<0.001)。

表2 不同送检标本mNGS与培养报阳时间和检测感染病原体种类对比

mNGS与CMT检测效率对比本研究mNGS对感染病原体检测灵敏度和准确度强于CMT(P=0.014),而特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)均无明显差异(表3)。

表3 mNGS与CMT诊断效率对比

讨 论

目前已知感染性疾病的病原体高达上万种,CMT仅能覆盖一小部分常见病原体,检测结果依赖医师判断和实验室水平[12]。此外经验性抗生素治疗造成假阴性,体液采样不充分、病原体载量少、培养周期长,胞内菌、苛养菌、病毒不可培养等因素,造成工作中较多感染无法明确病原体[13]。而服用免疫抑制剂的CKD患者,常见病原体感染时部分临床表现与普通人群存在差异,是罕见病原体的易感者和新发病原体感染的“前哨兵”,更需早期得到初始有效的抗感染治疗。

mNGS因其敏感、快捷、高效的优势,在诊断疑难感染的同时也存在一些争议[14]。华山医院在服用糖皮质激素的免疫抑制患者中发现，血液、BALF、穿刺液等多样本送检mNGS,对感染诊断的灵敏度和特异度分别为80.6%和87.1%,其结果不受免疫抑制程度影响,利用mNGS指导抗生素治疗成功率显著高于经验性治疗(81.8%vs52.6%)[15]。美国圣裘德儿童研究医院发现在血流感染发病的前3天,血液mNGS就可以提前发现感染病原体,其预测灵敏度为75%,特异度为91%[16]。但美国德克萨斯州儿童医院发现CMT与mNGS结果基本相同,几乎没有提高诊断价值。当mNGS鉴定出其他病原体时,仅26%的患者调整了抗生素[17]。我国专家共识推荐对于临床疑似感染的危重或免疫抑制患者,在完善CMT同时,采集疑似感染部位的标本送检mNGS,当原发感染灶病原学检测阴性或无法送检适合标本的情况下,可送检血液作为二线检测方法[18]。

国家肾脏疾病临床医学研究中心既往研究发现通过血液mNGS诊断耶氏肺孢子菌肺炎(PJP)的特异度显著高于CMT[19]。mNGS检测巨细胞病毒混合感染有助于评估PJP患者的免疫抑制水平和危重程度[20]。本研究发现，mNGS能提高免疫功能低下的CKD患者感染病原体检测的灵敏度、准确度和混合感染检出率,缩短报阳时间,可快速发现耶氏肺孢子菌、曲霉菌、结核分枝杆菌、军团菌等难以培养的病原体和马尔尼菲篮状菌、诺卡菌、非结核分枝杆菌、鹦鹉热衣原体等罕见病原体,展现了重要临床应用价值。

本研究发现mNGS和CMT的特异度、PPV、NPV无明显差异,NPV均偏低,42.31%的临床诊断感染组患者不能通过mNGS找到病原体,仅凭mNGS阴性并不能排除感染。ANCA相关肾炎和LN活动时CRP等炎症指标升高[21],部分抗GBM肾炎患者以发热为起病表现[22],弥漫性肺泡出血与肺部感染的胸部CT表现难以鉴别。上述CKD患者需要结合病史、症状、体征、实验室及影像学检查,结合多部位病原体检测结果综合评估,才能决定强化抗生素亦或加大免疫抑制剂量。本研究发现血液、BALF、深部痰液、浆膜腔积液等标本mNGS与培养的检测一致性均偏低,脑脊液的细菌、真菌检测一致性虽达90.0%,但仍有2例患者仅能通过mNGS确诊颅内病毒感染,部分患者的念珠菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌等病原体不能通过mNGS鉴定,而培养可发现,提示mNGS检测方法的稳定性有待进一步提高,两种检测方法互为补充,需要联合应用,而非替代关系。

理论上mNGS具有检测宿主中任何微生物的能力,可以预见将来在感染前病原体定植鉴定、宿主和微生物基因表达分析、治疗后病原体负荷和抗生素耐药性、医院获得性血流感染风险评估、甚至疫情调查和识别传播途径等方面应用前景广泛[23]。后续我们将探索mNGS能否预测导管相关血流感染,对条件致病微生物在不同免疫状态和CKD严重程度中的变化进行深入研究[24]。

本研究为单中心回顾性研究,对感染的临床诊断具有一定主观性,未纳入入院前感染病原体已明确的患者,对本研究的检测效率评估有一定干扰。近年来mNGS检测技术不断改进和微生物大数据库的即时更新,对该检测手段的一致性存在一定影响。

综上所述,mNGS能增加免疫功能低下CKD患者感染病原体检测的灵敏度和准确度,缩短报阳时间,提高混合感染、机会性感染、罕见感染病原体检出率,有助于准确、及时地调整药物治疗,展现了重要临床应用价值。