木质化鸡胸肉的发病机制与肌肉修复研究进展

张鑫蕊,邢通,张林,高峰

(南京农业大学动物科技学院/江苏省动物源食品生产与安全保障重点实验室/江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏 南京 210095)

鸡肉具有较高的营养价值、良好的感官特性,当前肉鸡产品已成为居民消费中不可缺少的部分,是保障和平衡肉类供应的最主要产品。为了满足日益增长的市场需求,科研人员不断对生长速度快、鸡胸肉产量高的品种进行选育[1]。然而,目前禽肉生产过程中正面临一些新的问题,快速生长的肉鸡品系在生长率和胸肌产量提高的同时伴有如木质化鸡胸肉(wooden breast,WB)等肌肉疾病的发生[2]。与正常鸡胸肉相比,WB的胸大肌头部触感坚硬,尾脊突起,厚度变大,这些特性会降低人们对鸡胸肉的感官评价[3]。肉品质方面,WB的系水力和腌料吸收率较低,脂肪含量和胶原蛋白含量较高,从而造成适口性下降,这会影响到人们对鸡胸肉的购买欲望,对家禽行业造成一定的影响[4]。当前国内对WB的研究报道较少,本文将从WB的发病机制及肌肉修复2个方面进行综述,以期为解析WB的形成机制提供一些理论支持。

1 木质化鸡胸肉的发病机制

1.1 缺氧

血液将氧气和营养物质输送到身体的各个组织,同时把二氧化碳和废物从组织中带走[5]。Sihvo等[6]发现,WB的毛细血管密度低于正常鸡胸肉。Mutryn等[7]报道,WB的肌肉损伤程度和毛细血管密度明显相关。WB的肌纤维直径和横截面积显著高于正常鸡胸肉,这可能是造成WB毛细血管密度下降的原因[8]。肌纤维尺寸变大会减少肌膜周围可供毛细血管使用的空间,增加氧扩散和废物清除的距离,导致供氧不足的发生,WB的形成与肌肉缺氧有着直接的关系[7-9]。氧分压(PO2)和氧饱和度(SO2)是判断机体是否缺氧的重要指标,Lake等[10]通过血气分析仪对肉鸡的静脉血进行血气检测,发现发生WB这一肌病的肉鸡其PO2和SO2均显著低于正常肉鸡。Livingston等[11]报道,WB的严重程度与PO2降低显著相关。WB的二氧化碳分压(PCO2)显著升高,提示WB中存在由肺通气不足所导致CO2不能及时排除体外的现象[10,12]。

此外,在分子水平上缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是细胞对缺氧反应的主要调节因子。Malila等[8]报道,WB中的HIF-1α表达量显著高于正常鸡胸肉,HIF-1α的激活可能是导致WB纤维化发生的重要原因。缺氧条件下,HIF-1α能够稳定表达并积累,进而激活细胞中的结缔组织生长因子、赖氨酸氧化酶、转化生长因子β(TGF-β)等诸多与胶原蛋白调节相关因子[13]。持续缺氧的状态会使上述由HIF-1α所激活的因子过表达,导致细胞外基质过度累积而发生纤维化[14-15]。

1.2 离子稳态失衡

在线粒体内膜中,氧作为电子传递链末端的电子受体,当细胞处于缺氧状态时,会导致线粒体的氧化磷酸化受到抑制,使ATP的生成量减少[16-17]。机体在正常生理状态下,细胞膜上的钠钾泵通过主动运输的方式将Na+运输至细胞外,K+运输至胞内,这个过程需要ATP进行供能[18]。当ATP生成减少时会导致钠钾泵效率降低,使Na+滞留在胞内[18],为了维持胞内的离子平衡,细胞膜上的Na+/Ca2+交换器发生逆转,促使Na+外流,Ca2+内流,以维持胞内离子稳态[17]。因ATP生成量减少以及能量的消耗,细胞膜上的钙泵不能将Ca2+泵出细胞,这会造成细胞内Ca2+的积聚,而大量的Ca2+内流会通过激活胞内的磷脂酶对细胞膜造成破坏,使得更多的Ca2+进入细胞[17]。Zambonelli等[19]发现WB中的Na+和Ca2+含量均显著高于正常鸡胸肉。钠含量的增加可能与SLC9A7基因转录升高有关,该基因能够编码钠/质子转运蛋白[20]。对转录组测序后发现,WB中与胞内Ca2+浓度变化有关的基因相对于正常鸡胸肉发生显著变化,如磷脂酶A2能够被Ca2+激活并对细胞膜造成损伤[7]。因此,由缺氧造成的胞内离子紊乱,损伤细胞的结构和功能,导致肌纤维内部水分转移至肌原纤维网络外,使肌肉中的不易流动水变成自由水而加剧水分的流失,这可能是导致发生WB的系水力乃至肉品质下降的重要原因。

1.3 氧化应激

目前,胸肌缺氧和氧化应激作为WB的诱因,在有关WB的多个组学研究中均得到印证[14,19]。在缺氧条件下,线粒体是活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要场所,也是ROS攻击的重要靶点[21]。ROS会对线粒体膜及线粒体呼吸链复合酶等造成伤害,过量的ROS可能造成线粒体不可逆损伤[21]。潘晓娜等[3]发现,WB肌肉中ROS浓度远超出正常鸡胸肉水平,对WB组织的超微结构观察后发现WB中的线粒体出现肿胀和空泡化、内部嵴大量分裂甚至消失的现象。而线粒体的结构完整性遭到破坏是细胞渗透失衡和缺氧的典型表现[22]。当线粒体结构异常时,会发生氧化应激而促进脂褐素的形成,脂褐素是在溶酶体中由细胞内蛋白质和脂质过度交联而形成的一种不可降解色素[23]。Hasegawa等[24]发现WB中萎缩肌纤维的细胞质内存在大量的脂褐素颗粒,提示较高水平的氧化应激和脂褐素的积累与WB的发生有关。Abasht等[25]发现WB中出现了氧化应激相关的生物标志物,如1-甲基组氨酸的积累表明机体发生了氧化应激,组氨酸衍生物肌肽和鹅肝肽含量的下降表明机体氧化还原平衡遭到破坏。WB中与氧化还原状态有关因子的变化进一步印证了Abasht等[25]的结果,如羰基、丙二醛和脂质过氧化物的含量均显著升高,表示发生WB机体存在由ROS过量生成所导致的氧化损伤[3-4]。由于缺乏ROS的清除机制,ROS导致的氧化应激会不断损伤细胞膜和线粒体膜,导致肌纤维的形态结构和线粒体结构发生变化[26]。WB中大范围的肌细胞膜完整性受损和蛋白质氧化损伤可能是造成其肉质性状下降的主要原因[27]。此外,Xing等[28]发现,发生WB肉鸡的肝脏ROS和氧化产物水平升高,抗氧化能力增强。因此,我们推测由胸肌缺氧导致ROS增加,引起氧化还原稳态的改变和氧化应激的发生可能是导致WB机体损伤的开端。

1.4 炎症反应

肌细胞缺氧会导致离子稳态失衡及氧化应激的发生,这会对肌细胞造成损伤[17,26]。炎症是动物机体对各种因素及其所引起的损伤产生的防御性反应,其基本变化包括炎灶局部组织细胞的变质、渗出和增生,伴随着白细胞增多[29]。机体在炎灶中所出现的细胞反应主要是白细胞的渗出,白细胞是炎症细胞的主要来源[30]。损伤的肌肉组织被炎症细胞浸润,可通过苏木精-伊红(HE)染色或马松三色染色后观察[31-32]。潘晓娜等[3]对WB进行HE染色发现,WB中部分退化的肌纤维被炎症细胞所浸润。在炎症反应中,渗出的白细胞主要有中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和在组织中广泛分布的巨噬细胞等先天免疫细胞,它们与适应性免疫应答细胞(T细胞)共同构成了炎症细胞群体[29-30]。由缺氧导致的细胞损伤首先会激活中性粒细胞,将其招集至损伤部位,释放ROS和蛋白酶,进一步放大损伤和局部炎症[33]。嗜中性粒细胞还能够诱导巨噬细胞浸润损伤部位,二者能够对细胞碎片进行清除[31]。巨噬细胞包括M1和M2两种亚型,其中M1巨噬细胞是促炎细胞,在宿主抵抗感染的防御中发挥核心作用,而M2巨噬细胞与抑炎反应相关[34]。Ferreira等[35]发现WB中巨噬细胞密度显著高于正常鸡胸肉。在炎症发生阶段,M2巨噬细胞和T细胞会对损伤部位的炎症进行清除[31]。其中辅助性T细胞按照功能的不同分为辅助性T细胞1(T helper 1 cell,Th1)和辅助性T细胞2(T helper 2 cell,Th2),二者分别以介导细胞免疫反应和体液免疫反应为主[36]。在正常生理状态下,Th1和Th2相互抑制以保证机体的稳态;当Th1/Th2平衡被打破时会导致机体功能发生异常[36]。Xing等[37]发现,在WB中由Th1分泌的IL-1β、TNF-α及IL-6等促炎因子的mRNA表达水平显著增加,而由Th2分泌的IL-4和IL-10等抑炎因子的mRNA表达量下降。这是由于Th1和Th2之间存在着相互抑制的作用,Th1和Th2之间的平衡状态被打破可能会加重肌纤维的损伤和炎症[38]。由此推断,发生WB肉鸡在生长过程中其胸肌可能处于持续缺氧的状态,导致炎症反应持续存在而发生促炎刺激,造成细胞死亡。

2 木质化鸡胸肉中的肌肉修复

胶原蛋白增加造成组织纤维化以及异位脂肪沉积是WB的主要特征[39]。然而,目前还没有一个明确的机制来解释WB发生纤维化和脂肪沉积的成因。而卫星细胞(satellite cells,SC)发生功能障碍、纤维-脂肪祖细胞(fibro/adipogenic progenitors,FAP)和转化生长因子β(TGF-β)的激活可能在WB的肌肉修复过程中均发挥重要作用。

2.1 卫星细胞功能障碍

SC是一类存在于肌细胞基底膜与肌膜之间的成体干细胞[40]。在正常情况下,成年动物的SC处于休眠期,以静止未分化的状态存在[41]。在肌肉组织损伤后,由SC所介导的肌肉损伤修复和再生是一个精确调控的过程,SC能够在激活后发挥良好的增殖和分化能力,在骨骼肌损伤的修复和再生过程中发挥重要作用[42]。Daughtry等[43]发现,SC的数量和功能会随胸肌厚度及质量的增大而降低,推测现代肉鸡较高的胸肌增重率可能与SC的激活及孵化时SC群的再生能力有关。Meloche等[44]发现WB中肌源性干细胞的活性增加。另有报道称,WB的胸肌中与SC增殖和分化相关的成肌调控因子(包括Myf5、MyoD和Myogenin)的转录水平显著上调[45-46]。而Ferreira等[35]发现,轻度WB中肌卫星细胞标记物(Myf5+、MyoD+及Pax7+)占总细胞核比率显著高于重度WB,表明肌肉的自我修复和再生能力随着WB严重程度的增加而减弱。Velleman等[45]的研究表明,WB的肌肉修复重塑系统存在缺陷,WB的严重程度与SC介导的肌纤维再生过程中生长抑制以及胶原交联调节的改变有关。这表明WB中SC发生功能障碍可能是导致肌纤维修复受阻的重要原因。此外,一些研究表明,SC和血管细胞之间的信号传递是卫星细胞激活所必需的[47-48]。由于卫星细胞需要在毛细血管的21 μm范围内增殖,因此血管的形成是肌肉再生的必要条件[47-48]。而WB中毛细血管密度下降导致由血管提供的循环供应减少,可能会引起由卫星细胞介导的受损纤维的修复和再生受到抑制,此时结缔组织会代替肌纤维而发生纤维化[8,49]。

2.2 纤维-脂肪祖细胞的分化

在肌肉损伤时,FAP 能够被嗜酸性粒细胞所释放的IL-4激活,FAP 可以促进卫星细胞增殖分化融合,在骨骼肌愈合中发挥重要的作用[50]。WB胸肌中的血小板源性生长因子受体α多肽(与细胞外基质重塑相关)表达量显著上调,表明在WB中大量的FAP被激活[39]。FAP是一种多功能的祖细胞,具有成肌分化或成脂分化及成纤维分化3 种不同的分化潜能,但不能分化成肌原细胞[51]。FAP可能参与了WB的形成,这与SC发生功能障碍有关。正常肌纤维再生条件下,FAP处于增殖状态,此时SC可以抑制FAP分化,并在肌纤维修复后诱导FAP凋亡[52]。而在WB中,血管化程度低可能会导致SC发生功能障碍,使其无法抑制FAP分化为成纤维细胞及脂肪细胞[53]。此外,WB中的IL-4表达量下降,提示可能发生了由IL-4所介导的信号失活而导致肌肉发生功能障碍,进而刺激FAP的分化,造成骨骼肌中异位脂肪沉积和纤维化的发生[35,37,54]。目前,在WB中有关FAP的研究基本处于空白状态,而基于FAP的分化潜能推测其在WB的形成过程中可能发挥了重要作用。

2.3 转化生长因子β的激活

TGF-β是导致纤维化疾病发病的最有效的纤维化细胞因子,能够被HIF-1α所激活[13,55]。TGF-β家族配体二聚体与其膜上相应的Ⅱ型和Ⅰ型受体形成复合物,诱导Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体并激活其激酶活性,而后Ⅰ型受体招募并活化下游的Smad蛋白,诱导其进入细胞核中并与DNA结合,调节与纤维化有关基因的转录。值得注意的是,TGF-β的过表达也会促使成肌细胞向成纤维细胞转化[56-57]。Xing等[55]报道,WB可能是通过激活TGF-β/Smad信号通路,促进与胶原蛋白合成和交联的调节因子表达,增强肉鸡胸大肌肌肉的细胞外基质沉积而诱发严重的纤维化而形成的。

另一方面,TGF-β能够通过调控成肌调节因子来影响SC增殖与分化。SC的增殖和分化受到成肌调节因子控制,TGF-β可作用于所有成肌调节因子的基本螺旋-环-螺旋区域,在不影响其结合活性的情况下,通过降低其转录活性来抑制SC的增殖与分化,进而影响肌肉的修复与再生[57-59]。然而,目前尚无关于TGF-β激活与WB中由SC介导的肌纤维再生过程中生长抑制之间联系的报道,后续可针对此思路进一步的探索。

3 结论与展望

WB常发生在生长速度快、鸡胸肉产量高的肉鸡品系中。近年来,WB的发生率不断升高,对鸡肉品质及营养价值造成恶劣影响,给现代肉鸡产业带来了巨大挑战。因此,在保证高生长性能及鸡胸肉产量的基础上,降低WB的发生率是当前肉鸡生产中亟待解决的难点。

当前研究证实WB的发生与组织缺氧、离子稳态失衡、氧化应激及炎症发生息息相关,WB的发生过程所涉及的各项生理变化及相互影响的作用机制错综复杂。因此,迫切需要深入探索WB的发病机制并寻找有效的解决方案。此外,目前有关SC功能障碍、FAP的分化及细胞外基质沉积的研究在WB中较少报道,这些可能是导致WB发生纤维化与脂肪沉积的重要原因。所以,后期可以通过对WB中SC和FAP的激活、分化及功能发挥情况进行探索,进一步明确WB中的肌肉修复机制,为降低WB的发生率提供理论支持。