低分子量肝素一致性评价技术研究概况

武海军

山东省食品药品审评查验中心

陈少鹏*

滨州学院

肝素属于自然界中生物合成的最复杂的一类糖胺聚糖分子，主要表现在分子结构骨架的多变性和结构骨架上取代基的多样性，是迄今为止仍然不能被大规模人工合成或通过基因工程技术规模化表达的一类复杂多糖分子。尽管肝素已临床应用多年，但是科学界对肝素结构与活性的研究仍然不够明确，除了在抗凝、抗血栓领域具有相对比较成熟临床应用之外，肝素还具有多种潜在的生物活性和临床应用价值[1]。普通肝素作用于凝血因子 Ⅻa、Ⅺa、Ⅸa、Ⅹa 以及抗凝血酶Ⅲ等靶点，而低分子量肝素主要作用于凝血因子Ⅹa 和抗凝血酶Ⅲ等，代表药物包括依诺肝素、那曲肝素钙、达肝素钠、汀肝素钠和帕肝素钠等[2]。

近年来，全球各国药品监管部门均提高了糖胺聚糖类多组分药物的准入标准，同时强化了对已上市产品的全产业链监管。低分子量肝素由于生产工艺的不同，包括依诺肝素钠、那屈肝素钙和达肝素钠等不同通用名产品，但我国低分子量肝素市场还有一些品种尚不能完全按照国家药典标准归类到某一通用名或无法确定参比制剂。低分子量肝素属于多组分药物，其原料药与注射剂生产工艺复杂，无菌要求严格，给产品生产与质量控制带来较大的挑战。近年来，我国肝素一致性评价工作的政策引导和监督管理不断加强。2021年8月，国家药品监督管理局药品审评中心组织制定了《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》，低分子量肝素类仿制药的开发及一致性评价标准与国际市场接轨。查阅国家药品监督管理局药品审评中心网站最新信息显示，我国依诺肝素钠注射液、那屈肝素钙注射液、达肝素注射液通过一致性评价的生产企业分别有7家、3 家和1 家[3]。此外，仍有舒洛地特、汀肝素钠、帕肝素钠、贝米肝素、达那肝素等肝素产品尚未在我国上市或未实现国产化。本文参考国家药品监督管理局药品审评中心（Center for Drug Evaluation，CDE）、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA） 等机构发布的技术指南要求，对目前低分子量肝素多组分药物一致性评价技术要点进行详细的技术总结，为相关单位开展低分子量肝素一致性评价及监管部门开展技术审评和质量监管提供参考[4]。

1 低分子量肝素原料药一致性研究

FDA 和EMA 针对低分子量肝素生物一致性评价研究出台了相关规范，并且两个机构在技术层面的获批标准大致相同，均要求低分子量肝素应与原研药在结构分析、免疫原性检测、健康受试者的药学特征等方面保持一致。近年来，我国也相继发布了多项相关文件，不断规范低分子量肝素原料药一致性研究。本文针对相关技术指南、药典、文献等资料，对低分子量肝素的具体研究技术方案进行了介绍与解读。

1.1 低分子量肝素原料药理化性质一致性

1.1.1 低分子量肝素原料相对平均分子量及分子量分布的一致性对比研究

低分子量肝素属于多组分药物，糖胺聚糖寡糖分子组分呈正态分布特点，利用分子排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC） 原理对低分子量肝素进行初步分离，采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法进行分析。根据相关文献，需确保低分子量肝素分子量及分布符合国家药典标准要求，标准区间内各组分含量比率与原研保持一致，即按照分子量每500 道尔顿为一个区间进行含量百分率对比，以确保仿制的低分子量肝素与原研药各分子量范围区间内寡糖含量无明显差异。此外，关于原研药的选购，通常要求涵盖新生产和近效期至少6 批次的原研药。

1.1.2 特征低分子量肝素寡糖链的糖链指纹图谱一致性对比研究

目前，主要采用季铵盐涂渍色谱柱，以提高不同分子量与电荷分布糖胺聚糖分子的分离效率，然而该方法也存在稳定性差、重现性不高等问题，表现为不同色谱柱涂渍后分离变异系数大，同一色谱柱涂渍后样品出峰时间飘移现象明显等。根据分子排阻原理，采用高效分子排阻色谱 法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）检测四糖、六糖、八糖、十糖等特征寡糖组分的百分含量则可以避免上述技术问题。为获取更多寡糖片段结构信息，进一步采用液质联用方法对上述寡糖组分进行进一步分离，并对分离所得寡糖分子进行分子量结构解析，同时与原研药进行对比研究[5]。

1.1.3 总寡糖组分一致性对比研究

针对总寡糖组分一致性对比研究，通常先采用紫外光谱法和红外光谱法进行官能团鉴别，然后再采用核磁共振一维氢谱、核磁共振二维氢谱和核磁共振碳谱方法进行研究，其中应重点对特征信号峰的峰位移和峰强度进行对比研究，确保与原研药保持一致[6]。

钠含量和硫酸羧基比在一定程度上反映低分子量肝素硫酸基和羧基等取代基的密度，采用原子吸收光谱法和电位滴定法对低分子量肝素中的钠含量和硫酸羧基比进行对比研究是开展总寡糖组分一致性对比研究的重要研究内容。

1.2 肝素原料来源与降解方式的一致性

1.2.1 肝素原料来源的一致性对比研究

肝素应属自然界中生物合成的最复杂的一类糖胺聚糖分子，不同物种和同一物种不同的组织部位合成的糖胺聚糖结构具有明显差异，表现为分子量的差异、糖链骨架单元排布序列的差异和硫酸化度的差异等。因此，起始原料是影响低分子量肝素一致性的关键工艺参数之一。为确保肝素原料的一致性，目前从技术上主要采取两种方式进行控制，一是采用实时荧光定量PCR 对粗品肝素进行基因检测，根据粗品肝素中残留的核酸进行扩增，以确定是否有其他物种来源的肝素造成污染。二是采用核磁共振氢谱技术测定去蛋白肝素或肝素钠精品等中间体，根据特征高位移信号区的峰强度，通过建立警戒值，辅助判定肝素中间体是否含其他组织来源的肝素。

1.2.2 低分子量肝素降解方式的一致性对比研究

低分子量肝素通常采取β-消除降解、亚硝酸降解、过氧化氢降解等原理进行降解，其在糖链末端特征结构上存在显著差异，例如依诺肝素钠在降解过程中，在糖胺聚糖非还原末端存在特征双键，在糖链的还原末端还会产生的具有1,6-脱水衍生物结构，各国药典均规定其含量占全部糖的15%～25%[5]。又如肝素酶法降解的汀肝素则只在糖链非还原末端存在特征双键。目前，市面上主要通过紫外可见-分光光度法、肝素酶降解后的特征二糖分析、飞行时间质谱法（MALDITOF）以及糖基结构解析法等对降解方式一致性进行判定[7]。

1.3 二糖组成、寡糖序列以及低分子糖胺聚糖特征寡糖一致性

1.3.1 二糖组成一致性对比研究

目前，普遍采用肝素酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）联合酶降解法将糖胺聚糖分子彻底降解为二糖分子，再采用强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）对降解得到的二糖进行分离，并对比二糖标准品，对二糖组成与含量进行定性与定量研究，至少与三批次不同效期的原研药降解后的二糖做对比研究，以评价原料药在二糖组成方面的一致性。

1.3.2 低分子量肝素特征寡糖片段一致性对比研究

根据肝素酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）对糖胺聚糖分子酶切位点不同，采用一种酶进行定向酶切，所得寡糖片段分别通过SAX-HPLC或者反相高效液相色谱（reverse phasehigh-performance liquid chromatography，RPHPLC）法进行分离，进一步采用MALDI-TOF 对每一个寡糖分子峰进行结构解析[7-8]。也有文献曾报道采用亚硝酸降解，通过高效毛细管电泳法对寡糖片段进行解析，但该方法重现性不高，难以通过方法学验证[9]。

1.3.3 四糖与六糖一致性对比研究

四糖与六糖属于相对容易分离的寡糖分子，开展低分子量肝素四糖与六糖一致性研究可以一定程度反应一致性。采用分子排阻色谱法对糖胺聚糖组分进行粗分离得到四糖和六糖粗分离物，再采用强阴离子交换色谱法，对四糖和六糖粗分离物根据电荷密度不同进行进一步分离[10]，所得不同组分分别采用MALDI-TOF与核磁共振法对每一种四糖和六糖单体进行结构确证[11]。

1.4 低分子量肝素生物活性的一致性

生物活性一致性是确保制剂体内药效学生物等效性试验的关键，相关单位需参照《中国药典》（2020年版）对低分子量肝素抗Ⅹa 活性和抗Ⅱa 活性进行检测，以评估低分子量肝素在抗Ⅹa 和抗Ⅱa 活性上的一致性[12]。此外，据文献报道，还可以采用活化部分凝血活酶时间（activeated partial thromboplasting time，APTT）法检测原料药活性，以评估低分子量肝素活化部分凝血活酶时间的一致性[13]。

2 低分子量肝素制剂一致性研究

2.1 低分子量肝素制剂体内药效动力学一致性

由于低分子量肝素属于多组分糖胺聚糖，根据目前的技术研究水平，难以通过直接检测糖胺聚糖化合物浓度判断等效性。主要采用向健康受试者在空腹条件下以单剂量、双向交叉试验的形式皮下给药，并根据方案定时采集血样，离心取血浆测定血浆中抗F Ⅹa 和抗FⅡa 活性[14]。再根据相关数据完成血浆抗Ⅹa 活性与时间关系曲线图、血浆抗FⅡa 活性与时间曲线图，并计算所得受试制剂与原研药抗Xa活性和抗FⅡa 活性几何均值、比值，以评价体内药效动力学是否一致[15]。

2.2 低分子量肝素制剂免疫原性风险评估

临床使用中，肝素与低分子量肝素经常被发现存在发生肝素诱导的血小板减少症（HIT）的风险。这意味着针对低分子量肝素一致性评价，需要开展相关研究，以评估其引起潜在的HIT 风险。为规范低分子量肝素类产品的研究和开发，CDE 组织制定了《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》[15]。参考上述技术指南，并结合FDA 注册申报的依诺肝素钠制剂免疫原性研究风险评估项目，笔者建议该系列低分子量肝素产品免疫原性技术研究概况可分如下几部分开展。

2.2.1 低分子量肝素与血小板因子4 相互作用

血小板因子4（platelet factor 4，PF4）与低分子量肝素形成复合物的大小对肝素诱导的HIT 发病机制至关重要，有研究发现随着PF4-低分子量肝素复合物摩尔比的增加，形成PF4-低分子量肝素复合物的大小随之增加。而在PF4-低分子量肝素复合物形成过程中，其复合物大小、表面电荷及化学计量都具有至关重要的作用[16]。目前，可利用表面等离子共振技术研究低分子量肝素与PF4 亲和作用或利用圆二色谱（circular dichroism，CD） 法研究依诺肝素钠对PF4 二级结构的影响。通过光子相关光谱（photon correlation spectroscopy，PCS）法和 Zeta 电位技术研究复合物大小与表面电荷。其他适用的方法还包括分子排阻色谱结合紫外光（SEC-UV）分析技术和分子排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）分析技术、超速离心、场流分离（field flow fractionation，FFF）和原子力显微镜技术等[17]。

2.2.2 杂质风险评估

研究表明低分子量肝素中的杂质可增强产品的免疫原性，杂质的存在可能会改变低分子量肝素的识别、摄取、处理或呈现，以及改变与PF4 形成复合物的形态和大小，进而对免疫系统造成影响[18]。杂质对免疫原性的影响取决于其在最终产品中的性质和水平。因此，对低分子量肝素中杂质的研究至关重要，应结合原料药杂质谱研究数据，从起始原料引入的杂质、工艺杂质和降解杂质三方面进行系统的杂质风险评估，以证明产品免疫原性风险不高于原研药。

肝素是动物结缔组织中肥大细胞产生的一种结构复杂的糖胺聚糖分子，与蛋白质、核酸、脂类物质等多种生物大分子共存。通过起始原料引入的杂质包括蛋白质、核酸、有关物质、脂类物质、重金属等。蛋白质、核酸和有关物质三种杂质可参照《中国药典》（2020年版）相关方法和标准进行。重金属限度检测除参照《中国药典》规定的检查方法之外，还建议参照《欧洲药典》要求，采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法对重金属进行分类风险评估。脂类物质通常采用气质联用方法，通过建立脂质库，然后根据分子量结果进行对比研究，从而确认脂质谱和脂质含量。工艺引入杂质因产品工艺不同而存在较大差异，例如依诺肝素钠主要研究的特征工艺杂质包括氯化苄、苯甲醇、苄索氯铵盐、游离硫酸盐等。达肝素钠和那屈肝素钙研究的主要特征工艺杂质包括亚硝酸盐、亚硝胺、游离硫酸盐等。低分子量肝素降解杂质主要通过开展稳定性研究，考察过程中分子量和游离硫酸盐的变化进行评估。

综上，根据目前的技术水平，低分子量肝素杂质研究的策略主要从杂质类别入手进行系统研究。此外，杂质谱研究可作为开展低分子量肝素制剂免疫原性风险评估的主要依据。

2.2.3 体内外免疫风险评估

通过适当的体外和体内实验，证明仿制低分子量肝素和原研药的免疫调节效应，可进一步补充关于免疫原性风险的研究。如采用酶联免疫吸附测定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测肝素诱导的血小板减少症抗体IgG、IgA、IgM；血小板计数监测：先测基础血小板计数，每日皮下注射低分子量肝素，期间隔日测1 次，用药2 周；功能性测试：低分子量肝素诱导血小板聚集试验[19]。

3 针对低分子量肝素制剂一致性的常规研究

3.1 包装材料相容性研究

对于低分子量肝素制剂包装材料相容性研究建议可以参考《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》[20]等文件。主要针对低分子量肝素注射液预灌封注射器组合件中的玻璃针管、不锈钢注射针、氯化丁基橡胶活塞、聚异戊二烯橡胶针头护帽中的元素及有机物向低分子量肝素制剂中的迁移情况进行检测研究，对包装系统中可能迁移入药物的金属及非金属元素与有机浸出物进行定量测定，并进行系统的方法学验证试验，最终结合上述研究数据与产品稳定性数据进行安全性评估[21]。

3.2 其他常规研究

针对低分子量肝素成品制剂，除进行免疫原性研究、药效动力学研究和包装材料相容性研究之外，还需开展常规的加速稳定性研究、长期稳定性研究、低温冻融试验、推杆推动力实验等研究，以评估低分子量肝素制剂在常规储存条件下和极端条件下产品的分子量、活性和游离硫酸盐等有关物质的变化情况，并与原研药进行对比研究，以评估药品的安全性和有效性[22]。

4 结语

由于低分子量肝素属于结构复杂的糖胺聚糖类多组分药物，目前我国和美国按照化学药品进行注册管理，欧洲则按照生物制品进行注册管理。低分子量肝素系列药品存在诸多特性理化指标和生物活性指标，例如相对平均分子质量及分子量分布、抗Ⅹa因子活性、抗FⅡa 因子活性等，批次之间存在一定的波动，且糖胺聚糖分子通常极性强、结构复杂，即便结合多种分离技术和分析手段也难以较精细地表征其活性成分的全面一致性或相似性。由于分析技术的局限性意味着绝大多数低分子量肝素的多糖链可能无法表征。本文参考相关技术指南、药典、文献等资料，并结合低分子量肝素项目研发情况，对低分子量肝素一致性评价技术研究进展进行总结。可以预见，随着国内外糖胺聚糖分离纯化技术的提高，结构确证手段的进步，特别是我国仿制药一致性评价的推进，国产低分子量肝素在理化性质一致性、生物活性一致性、体内抗Ⅹa 因子与抗Ⅱa 活性一致性等方面会得到快速提升，将有助于提升我国肝素生产企业的国际竞争力和产业链控制力。