海参多糖提取分离及纯化的研究概述

于 双，李双双，2，宋志远，3，4，桑 雪，3，5，李 莹，3，4，范馨茹，3，5，赵前程，3，4，5

（1. 大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连116023；2. 大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司，辽宁大连116222；3. 大连市特色海洋功效成分开发与高值化利用重点实验室，辽宁大连 116023；4. 辽宁省水产品分析检验及加工技术科技服务中心，辽宁 大连 116023；5. 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁大连 116034）

海参不仅是传统的海洋食品，也是宝贵的药用资源，全球已知的海参品种达1 000 余种，其中，可食用海参有40 多种[1]。海参不仅蛋白质含量丰富，而且富含多糖成分，占海参体壁干质量的6%以上[2]。海参多糖有抗凝血、抗肿瘤、增强免疫力、降血脂、抗病毒等生物学活性，具有很高的药用价值[3]。目前，各种各样的海参多糖被提取、分离和纯化出来，而提取、分离和纯化方法对海参多糖的提取率、组成结构及生物学活性具有一定影响。总结对比了现有海参多糖提取、分离和纯化方法，旨在为海参多糖的开发与产业化应用提供理论支持。

1 海参多糖的提取方法

1.1 酶解法

酶解法是海参多糖提取最常用的方法，蛋白酶能水解肽键，使多糖与蛋白质有效分离，且不破坏多糖的结构[4]。海参多糖的酶解主要采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，尤以木瓜蛋白酶应用较为广泛。酶解法可以采用单一酶进行酶解，也可以采用多种酶联合进行酶解。

单一酶法主要采用木瓜蛋白酶，从海地瓜（Acaudina molpadioides）、白乳参（Holothuria fuscogilva）、黑海参（Holothuri atra）[5]、海瓜参（Cucumaria syracusana）[6]、刺参（Stichopus japonicas）[7]、北大西洋瓜参（Cucumaria frondosa）[8]、黄参（Stichopus naso）、沙参（Holothuria floridana）、大乌爪参（Holothuria tubulosa）[9]、菲律宾刺参（Hearsonothuria graeffei）[10]、糙刺参（Stichopus horrens）、绿刺参（Stichopus chloronotus）[11]、白底辐肛参（Actinopyga mauritiana） 和仿刺参（Apostichopus japonicus）[12]等海参中提取了多糖，多糖提取率介于3.19%～11.40%。

采用中性蛋白酶提取了海地瓜[13]和刺参[14]的多糖，多糖提取率为3.24%～13.80%，与木瓜蛋白酶酶解提取结果相近；为了提高多糖提取率，酶法也可以与超声辅助法结合使用，先采用超声波处理后再采用中性蛋白酶法处理，提取了刺参性腺多糖，提取率为6.09%，明显高于酶法（4.35%） 和超声法（5.47%）[15]，而且减少了酶的用量。采用胃蛋白酶提取了海地瓜[16]多糖，提取率仅为1.65%，明显低于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

双酶法主要采用胃蛋白酶和胰蛋白酶联合酶解，提取了刺参[17]多糖，提取率为1.46%；采用木瓜蛋白酶和复合蛋白酶，提取了仿刺参卵粗多糖，提取率为8.76%[18]。

1.2 碱法与酶解法联合使用

碱可以有效水解蛋白质中的肽键，使多糖与蛋白质有效分离，如采用氢氧化钾提取刺参多糖，提取率为7.96%[19]，也提取了玉足海参（Holothuria lcucospilota） 多糖[20]。但碱溶液容易破坏多糖结构，为避免多糖降解[21]，碱法常和酶法结合使用，一般不单独使用。从刺参[22]、东海乌参（Acaudina leucoprocta）[23]、黑乳参（Holothuria nobilis）[24]、东海乌参[25]、刺参、绿刺参和海地瓜[26]中提取多糖，多糖提取率为2.51%～8.29%。

1.3 热水浸提法

热水浸提法是动植物多糖提取的常用方法，采用80 ℃热水浸提海地瓜2 h，多糖提取率仅为0.628%[27]；为了提高多糖提取率，将热水浸提法与超声-微波法联合使用，刺参多糖提取率达12.39%[28]。

2 海参多糖的分离方法

2.1 乙醇沉淀法

海参多糖的分离常采用乙醇沉淀法，用2 倍或3倍体积的乙醇，可将仿刺参[29]、刺参[19]、海地瓜、黑乳参[30]、北极参[31]、花刺参[32]和沙参[33]等多糖分离出来；或采用最终体积分数为60%以上的乙醇溶液，分离得到白腹海参（Holothuria albiventer） 多糖[34]、梅花参（Thelenota ananas）、花刺参、绿刺参、黑乳参、白腹海参、糙海参（Holothuria scabra）、大乌爪参、球参、北极参（Holothuria impatien） 和叶瓜参多糖[35]；此外，通过分级醇沉可以将硫酸软骨素、岩藻聚糖硫酸酯和中性多糖有效分离，如采用40%乙醇可以将花刺参（Stichopus herrmanni）[36]、大西洋海参（Holothuria coluber）[37]和白腹海参[38]中的硫酸软骨素分离出来，50%乙醇溶液可使象牙参、梅花参和糙刺参的中性多糖得到分离[39]。

2.2 季铵盐沉淀法

季铵盐是一种乳化剂，能够与酸性多糖结合形成沉淀，常用于海参酸性多糖的分离，常用的季铵盐包括氯化十六烷基吡啶（CPC） 和十六烷基三甲基溴化铵（CATB）。采用CPC 分离多糖时，通常CPC溶液最终质量分数为0.5%，沉淀物加入氯化钠乙醇溶液溶解，再加入乙醇沉淀，使酸性多糖得到分离[40]。绿刺参[38]、地中海瓜参[6]、大乌爪参、沙海参（Holo-thuria arenicola）[41]、白斑海参（Holothuria polii）[42]、仿刺参[40]、北大西洋瓜参[8]、黄参、沙参、大乌爪参[9]和菲律宾刺参[10]，采用CPC 分离海参多糖，提取率为3.00%～8.06%。

采用CATB 分离多糖时，通常采用CTAB 溶液最终浓度为1.0%～1.3%[43]，将沉淀物采用乙醇碘化钠溶液处理，再经乙醇沉淀，将得到了巴塔哥尼亚海参（Hemioedema spectabilis）[43]、叶瓜参[44]、绿刺参和糙刺参[11]酸性多糖，提取率为3.60%～11.92%。

2.3 盐析法

盐析也常用于海参多糖的分离，通常采用乙醇与醋酸钾结合使用，分离了仿刺参、绿刺参、海地瓜[45]和花刺参[36]多糖，提取率为6.4%～8.1%。

3 海参多糖的纯化方法

3.1 离子色谱法

海参多糖通常采用阴离子色谱法纯化，将多糖按相同离子强度进行初步分离，常用的色谱介质包括DEAE- 纤维素（DEAE-Cellulose）[6，30，40]、快流速DEAE-琼脂糖凝胶（DEAE-Sepharose Fast Flow）[33]、强离子FPA98 树脂（Strong ion of FPA98 resin）[34，39]和DEAE- 葡聚糖（DEAE-Sephacel）[43]；此外，DEAE 葡聚糖凝胶（DEAE-Sephadex） 和快流速Q 琼脂糖凝胶（Q Sepharose Fast Flow）[25，38]也可用于海参多糖的纯化。

3.1.1 DEAE-纤维素

DEAE-纤维素广泛应用于多糖纯化，采用此方法，可从地中海瓜参[6]、黄参、沙参及大乌爪参[9]粗多糖中纯化得到硫酸软骨素组分；从黄玉参[30]、黄参、沙参及大乌爪参[9]粗多糖中纯化得到岩藻聚糖硫酸酯组分。

3.1.2 DEAE-琼脂糖凝胶

DEAE-琼脂糖凝胶也常用于多糖纯化，可直接纯化得到东海乌参硫酸多糖[46]，从沙参、菲律宾刺参和美国肉参[47]粗多糖中纯化得到硫酸软骨素组分；从绿刺参[38]、沙参、白斑海参[48]的粗多糖中纯化得到岩藻聚糖硫酸酯组分。

3.1.3 强离子FPA98 树脂

近些年，强离子FPA98 型树脂也常用于多糖的纯化，可以直接从大西洋海参、象牙参、梅花参[49]粗多糖中纯化得到岩藻聚糖硫酸酯组分；从大西洋海参[37]和象牙参[45]粗多糖中纯化得到硫酸软骨素组分；从秘鲁乌参（Pattalus mollis）[50]和糙刺参[51]粗多糖中得到了岩藻糖基化糖胺聚糖，从东海乌参粗多糖中得到了海参多糖[52]。

3.1.4 葡聚糖纤维素

近些年，葡聚糖纤维素也常用于纯化多糖，但需采用DEAE 葡聚糖凝胶进一步纯化。采用此方法，可以用于纯化大乌爪参、小乌爪参[43]、糙刺参[53]、绿刺参[11]、叶瓜参[44]和糙刺参多糖[53]。

3.2 凝胶色谱法

3.2.1 葡聚糖凝胶

经过离子色谱分离纯化后，通常需要采用凝胶色谱进一步纯化。一般采用葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200[40]、G-150 或G-100[30]。例如，经DEAE-纤维素纯化后，进一步采用葡聚糖凝胶G-200 使刺参多糖得到纯化[40]，获得刺参岩藻聚糖硫酸酯组分和硫酸软骨素组分[54]。将海地瓜粗多糖采用快流速Q 琼脂糖凝胶纯化后，采用葡聚糖凝胶G-150 进一步纯化，得到岩藻聚糖硫酸酯组分和硫酸软骨素组分[27]。

经DEAE-葡聚糖初步纯化多糖后，进一步采用葡聚糖凝胶G-100 可以纯化得到巴塔哥尼亚海参[43]、大乌爪参、小乌爪参（Holothuria stellati）[53]、叶瓜参[44]硫酸软骨素组分和糙刺参[53]岩藻聚糖硫酸酯组分。

3.2.2 聚丙烯酰胺葡聚糖

经过阴离子色谱分离纯化后，采用聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl） S-500、S-400 和S-200[25]可以使多糖得到纯化。例如，粗多糖经DEAE-纤维素纯化后，进一步采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500 HR[55]，得到纯化的刺参多糖；经快流速Q 琼脂糖凝胶分离纯化后，进一步采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200，可纯化得到东海乌参[13]和刺参岩藻聚糖硫酸酯组分和硫酸软骨素组分，采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-500 纯化得到北大西洋瓜参岩藻聚糖硫酸酯组分[8]。

4 结语

近年来受疫情影响，海参多糖的保健功能已成为全球研究热点，各种海参多糖相继被提取出来，对其活性和结构的研究也不断深入，为海参多糖开发和产业化应用奠定了理论基础。然而，目前海参多糖的提取分离和纯化方法还未用于产业化生产，提取和纯化方法有待进一步完善，可以通过开发适用于产业化生产的海参多糖分离设备，充分结合传统海参加工工艺，使海参多糖能够从实验室科研水平进入产业规模化的生产。此外，充分利用海参加工副产物，开发和利用海参多糖，能够带来巨大的收益，实现海参资源的高效利用，提升海参加工附加值和综合经济效益，促进海参产业高质量发展。