建立稳定表达人有机阴离子转运体OAT1 细胞的活性检测方法及抑制剂的筛选*

韩学诚，唐雪妮，夏宗玲

1 南京医科大学附属常州二院 药学部，常州 213003;2 常州市德安医院 药剂科，常州 213000;3 苏州大学附属第三医院 药学部，常州 213000

人有机阴离子转运体1（human organic anion transporter 1，hOAT1）是位于肾脏的主要药物转运体之一，可介导将血液中的有机阴离子转运到近端小管上皮细胞内，与尿酸分泌和排泄密切相关[1]，并在药物和毒物的排泄中发挥重要作用。6-羧基荧光素与尿酸转运蛋白1[2]、OAT1[3]都有很强的亲和力，常被选为再摄取抑制试验的底物，用于活性检测与抑制剂的筛选。在临床诊疗中，多种药物联合使用常存在竞争或协同作用，因此针对hOAT1 转运体底物及抑制剂的研究有助于指导临床安全用药。本研究旨在建立hOAT1 细胞中经典底物含量的检测方法，用于hOAT1 细胞活性的测定及其抑制剂的筛选。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

HERA cell 150 CO2细胞孵育箱（Thermo scientific）；GI80DP 高压灭菌器（致微（厦门）仪器有限公司）；CKX41 显微镜（OLYMPUS）；SYNERGY2 多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；万分之一电子分析天平（塞多利斯科学仪器（北京）有限公司）；5427R 高速台式离心机（德国Effendorf 公司）；旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；HD-1030A 超声波清洗仪（宁波市凌大超声波设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

6-羧基荧光素（6-CF，批号C105327）、替格瑞洛活性代谢产物（ARC 124910XX，批号CAS220347-05-7，纯度95%），奥美沙坦（批号O124944）、厄贝沙坦（批号I129263）、替米沙坦（批号T129239）、丙磺舒（批号P129440），纯度均≥98%，均购于南京倍尔博实验器材公司；替格瑞洛原药（石药集团欧意药业，批号20000816-574210314，纯度99.6%）；阿托伐他汀钙、辛伐他汀、瑞舒伐他汀钙（浙江江北制药公司，批号分别为20201228、20210310、20210324，纯度均≥99%）；缬沙坦原料药（常州四药厂，批号A202104301，纯度≥99.9%）；Gibco DMEM 杜氏改良Eagle 培养基（DMEM）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）；Hank’s 平衡盐溶液（无酚红，伊势久连云港生物科技公司）；胰酶细胞消化液（0.25%胰酶）、青霉素-链霉素溶液（100X）、二辛喹酸（BCA）蛋白测定试剂盒（均碧云天生物技术公司）；水为超纯水。

1.3 细胞

空载体pcDNA3.1（+）的犬肾传代细胞（MDCK）（阴性对照组，简称MDCK-mock），细胞（第三代）及MDCK-hOAT1 细胞（第六代），由浙江大学药物分析与代谢实验室赠予；培养液为含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U·mL-1青霉素-链霉素的DMEM 培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。当细胞生长至80%～90%融合度时，通过胰酶消化传代。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 6-CF 贮备液 精密称取6-CF 3.53 mg 置于100 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。取该溶液0.8 mL 置于10 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得8 μmol·L-1的6-CF 溶液。

2.1.2 抑制剂筛选溶液 精密称取经典抑制剂丙磺舒5.62 mg、待筛选药品瑞舒伐他汀钙20.78 mg、替米沙坦10.34 mg、奥美沙坦9.42 mg、厄贝沙坦7.5 mg、缬沙坦9.22 mg，置于10 mL 量瓶中，加Hank’s 溶液溶解并稀释至刻度，混匀得2 mmol·L-1的溶液，待用。精密称取待测药品替格瑞洛10.04 mg、替格瑞洛活性代谢产物（ARC124910XX）10.02 mg、辛伐他汀8.62 mg、阿托伐他汀钙24.84 mg，置于10 mL 量瓶中，加二甲基亚砜（DMSO）20 μL 溶解后，置于37℃恒温超声仪内，逐渐加入Hank’s 溶液溶解并稀释至刻度，混匀得2 mmol·L-1的溶液，待用。每次用前超声溶解30 min。

2.1.3 细胞裂解液 称取氢氧化钠0.2 g 置于15 mL试管中，加灭菌注射用水10 mL，溶解，摇匀，即得。

2.2 样本处理与测定

样本处理：将MDCK-hOAT1 细胞及MDCKmock 细胞按密度1×105cell/孔种于24 孔板，在37℃、5% CO2条件下培养48 h 后，进行经典底物6-CF 的摄取实验。每株细胞分为两组，一组为底物组，另一组为抑制剂筛选组，每组平行3 份。细胞用37℃Hank’s 清液洗两遍，底物组加250 μL 含6-CF 4 μmol·L-1的Hank’s 溶液，抑制剂筛选组加250 μL含4 μmol·L-16-CF 和1 mmol·L-1抑制剂的Hank’s溶液，37℃孵育5 min。用冰冷的PBS 溶液500 μL 洗3 次，终止孵育。最后采用0.5 mol·L-1的NaOH 溶液250 μL 裂解细胞，反复吹匀后移至96 孔板中，待测。

样品荧光吸光度测定：采用SYNERGY2 多功能酶标仪，样品在激发波长485 nm、发射波长520 nm处检测荧光吸光度。

样品蛋白浓度测定：釆用BCA 蛋白测定试剂盒测定细胞裂解中蛋白浓度。测定步骤：①工作液配制：按50 体积BCA 试剂A 加1 体积试剂B 配制适量工作液，混匀后室温放置，24 h 内稳定。②工作曲线制备：取适量蛋白标准液，用纯化水稀释至浓度为0.5 mg·mL-1。分别取0、2、4、8、16、20 μL 标准液至96孔板中，加纯化水补足至20 μL。③取稀释后的待测样品20 μL 至96 孔板中，待测样品与标准蛋白液各加入200 μL BCA 工作液，37℃反应30 min。④采用SYNERGY2 多功能酶标仪测定各孔在562 nm 处的吸光度，根据标准曲线计算待测样品蛋白浓度。

以6-CF 的荧光吸光度对蛋白浓度的比值作为6-CF 的细胞内积聚量指标，用于衡量转运体hOAT1 活性的指标[4]。抑制作用为化合物降低MDCK-hOAT1 摄取6-CF 进入细胞内的比率，该值越高表示化合物抑制作用越强。

2.3 标准曲线的制备

取一定量6-CF 贮备液，加Hank’s 溶液稀释成含6-CF 0.08、0.16、0.32、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1的系列溶液，按“2.2”项下方法处理后检测，记录6-CF的积聚量对蛋白浓度的比值。以溶液中待测物6-CF浓度（X）为横坐标，待测物的荧光吸光度对蛋白浓度的比值（Y）为纵坐标进行回归分析，得回归方程为Y=1102X+111.94（r=0.999 1）。结果表明，MDCKhOAT1 及MDCK-mock 细胞中6-CF 浓度与荧光吸光度对蛋白浓度的比值在检测浓度0.08～3.2 μmol·L-1范围内呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

取一定量6-CF 贮备液，加Hank’s 溶液稀释成含6-CF 0.16、0.8、2.4 μmol·L-1的溶液，按“2.2”项下方法处理后上机检测，同日内重复测定3 次、连续测定3 天，计算6-CF 的日内和日间精密度。见表1。

表1 精密度试验结果（，n ＝3）

表1 精密度试验结果（，n ＝3）

2.5 回收率试验

取一定量6-CF 贮备液，加Hank’s 溶液稀释成含6-CF 0.16、0.8、2.4μmol·L-1的溶液，按“2.2”项下方法处理后上机检测，每个浓度进行3 个样本分析，计算方法回收率（即将所得信号比值代入回归方程，求得测定值，与加入量比较），结果准确度良好，见表2。

表2 回收率试验结果（，n＝3）

表2 回收率试验结果（，n＝3）

2.6 稳定性试验

制备浓度为0.16、0.8、2.4 μmol·L－1的6-CF 溶液，按“2.2” 项下方法处理至“采用0.5 mol·L－1的NaOH 溶液250 μL 裂解细胞”后，将样品放置在室温及4℃冰箱内，分别于0、6、24、48、72 h 上机检测激发波长A485nm、发射波长520 nm 处荧光强度，并测定的吸光度A562mm，计算蛋白浓度，计算6-CF 的浓度对蛋白浓度的比值。结果RSD 均＜6.48%，表明样品溶液在室温及4℃下放置72 h 内稳定。

2.7 MDCK-hOAT1 活性的测定

以MDCK-hOAT1 经典抑制剂丙磺舒为阳性对照，以MDCK-mock 为阴性对照，按“2.2”项下方法处理，上机测定MDCK-hOAT1 活性，结果见表3。

表3 MDCK-hOAT1 活性测定结果（，n＝3）

表3 MDCK-hOAT1 活性测定结果（，n＝3）

2.8 DMSO 对细胞活性的影响

针对水溶性差的待测物，在配制时使用了DMSO 助溶，配制浓度为1%、0.1%的DMSO 溶液，按“2.2”项下方法处理，上机测定其对MDCK-hOAT1的抑制作用，结果表明0.1%的DMSO 溶液对细胞活性无影响，见表4。

表4 DMSO 对MDCK-hOAT1 活性影响（n ＝3）

制备浓度为1 mmol·L－1的丙磺舒溶液、替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢产物（ARC124910XX）、阿托伐他汀、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀溶液，按“2.2”项下方法处理，上机测定其对MDCK-hOAT1 的抑制作用，结果表明1mmol·L－1替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢产物（ARC124910XX）、阿托伐他汀、缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、辛伐他汀、瑞舒伐他汀、丙磺舒对OAT1 的抑制作用分别为19.53%、9.56%、11.17%、103.45%、110.34%、93.41%、90.33%、79.84%、95.22%、107.88%，见表5。

表5 MDCK-hOAT1 抑制剂筛选结果（n ＝3）

3 讨论

人OAT1 细胞常见的经典底物有对氨基马尿酸[4]、6-CF[5]等，由于对氨基马尿酸需要使用高效液相联合质谱进行含量测定，虽灵敏度高，但对仪器设备要求高，样品处理复杂，故本研究以具有荧光吸光特性的6-CF 作为转运体活性测定的底物，样品处理简单、检测仪器可及性强，方法简单可行。

本研究建立的MDCK-hOAT1 细胞中6-CF 含量测定方法，在0.08～3.2 μmol·L－1范围内线性关系良好，测定方法简捷，日内、日间精密度，回收率达到生物样品检定要求，用于hOAT1 细胞活性的测定与其抑制剂的筛选效果良好。

通过hOAT1 转运体的经典抑制剂丙磺舒（阳性对照）和转染的空载细胞MDCK-mock（阴性对照）对MDCK-hOAT1 细胞活性进行验证，6-CF 在MDCK-mock 和MDCK-hOAT1 细胞中孵育相同时间，两种细胞内测得6-CF 浓度，存在显著差异（P ＜0.01），说明MDCK-hOAT1 细胞具有转运6-CF 进入细胞内的活性。同时，两种细胞中均加入抑制剂丙磺舒，MDCK-hOAT1 细胞转运活性被抑制，检测细胞内6-CF 含量降低（抑制率94.93%），MDCKmock 细胞内6-CF 含量无变化。结果表明MDCKhOAT1 细胞具有转运活性，可用于hOAT1 转运体相关药物相互作用的研究。

DMSO 常用于细胞冻存液中，是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞的损害；但其本身具有细胞毒性，有报道显示[6]其用于明确要浸提极性物质时，细胞培养基内有机溶剂体积分数不应超过1%[6，7]，反应体系中其最终使用体积分数不宜超过0.5%。本实验中替格瑞洛、ARC、辛伐他汀、阿托伐他汀钙水溶性差，在溶液配制中尝试使用1%、0.1% DMSO 终浓度进行样品溶液配制，并通过实验验证在0.1% DMSO 浓度时对细胞活性无影响，不干扰抑制实验结果。在有机阴离子转运体相关报道中[8]，大多未提及脂溶性高的药物在转运体活性研究中溶液的处置方法。

抑制实验初筛结果表明，缬沙坦、奥美沙坦、厄贝沙坦、替米沙坦、瑞舒伐他汀在与MDCK-hOAT1经典底物丙磺舒同样浓度时，其对MDCK-hOAT1细胞转运活性显示出了同样的抑制作用，其中奥美沙坦的抑制作用甚至强于丙磺舒，可进一步研究相关药物相互作用。而替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢产物（ARC 124910XX）、阿托伐他汀的抑制率均显著低于丙磺舒，表明其不是MDCK-hOAT1 的抑制剂。