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一测多评法同时测定促育生精合剂中6 种成分的含量*

2022-11-17马大龙姜国萍王路平于晓阳孙向红刘洪玲

药学与临床研究 2022年5期
关键词:新妇桃苷淫羊

马大龙,姜国萍,王路平,于晓阳,孙向红,刘洪玲

青岛大学附属医院 药学部,青岛 266003

“促育生精方”是以中医理论为指导,是青岛大学附属医院近年来针对弱精症发病机理、中药药理及中药治疗少精、弱精症而研发的方剂,临床使用十几年来有效率达85%以上[1]。全方由淫羊藿、菟丝子、巴戟天、知母、何首乌、沙苑子、仙茅、蛇床子、杜仲、山萸肉、黄精、土茯苓、知母、牛膝等16 味中药配伍组成,主要用于治疗少精男性不育症。方中淫羊藿为君药,补肾壮阳,祛风除湿,主治肾虚阳痿、精冷不育;臣药菟丝子,滋补肝肾、固精缩尿;佐以仙茅、巴戟天、蛇床子等药材,温阳益肾;辅以山萸肉、枸杞子、黄精、沙苑子等生精血;另从肾精亏虚、精道阻滞角度,新增土茯苓、黄柏、知母滋阴降火,牛膝、赤芍活血化瘀。全方诸药配伍相得益彰,共奏补肾阳、益肾精,养血清热,除湿祛瘀之功效[2,3]。

为了建立促育生精合剂的质量评价体系,本实验采用高效液相色谱一测多评法(HPLC-QAMS),以方中淫羊藿的有效成分淫羊藿苷作为内参物,对合剂中金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷等多种黄酮类成分同时进行含量测定,为该合剂的质量稳定性和临床有效性提供科学依据。

1 仪器与药品、试剂

高效液相色谱仪(Primaide 6000 型,日本日立公司);Zirbus 实验室型冷冻干燥机(VaCo 2,德国IKA 公司);旋转蒸发仪(RV8,德国IKA 公司);SQP型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

对照品:淫羊藿苷(批号T05D9B76755,纯度≥98%)、落新妇苷(批号Y20J9H66031,纯度≥98%)、金丝桃苷(批号Y08N9X74602,纯度≥98%)、沙苑子苷(批号KS0916CA14,纯度≥98%)、芒果苷(批号P04M9F60454,纯度≥98%)、宝藿苷(批号T19D9Z77828,纯度≥98%)均购自上海源叶生物科技公司;促育生精合剂(批号:20201208、20210113、20210209,规格250 mL/瓶),由本院提供。乙腈、甲醇为色谱纯,其余试剂为分析纯;水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(WondaSil C18Superb 5 μm(4.6 mm×250 mm));流动相:乙腈(A)-0.04%磷酸水溶液(C)(梯度洗脱:0~25 min,10%~15% A;25~55 min,15%~20% A;55~70 min,20% A;70~100min,20%~30% A;100~120min,30%~50% A;120~130 min,50%~60% A);柱温:30℃;检测波长:359 nm;流速:0.8 mL·min-1;进样量:10 μL。液相色谱图见图1。理论塔板数不低于3000,分离度均大于1.5。表明淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷6 种成分与相邻色谱峰可较好分离,且阴性对照没有干扰。

图1 高效液相色谱图

2.2 对照品储备液和混合对照品溶液的制备

精密称取淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷对照品各适量,分别制成0.310、0.472、0.673、0.315、0.242、0.431mg·mL-1的6 种对照品储备液。精密量取6 种对照品储备液各4mL,置于同一10 mL 的量瓶内,甲醇定容;0.45 μm 微孔滤膜滤过,分别制成含上述化合物124.0、188.8、269.2、126.0、96.8、172.4 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液和阴性样品溶液的制备

按照促育生精方处方组成作前期优化工艺,进行提取、浓缩,制得生药量为1 g·mL-1的合剂;精密量取合剂5.0 mL,加甲醇20 mL,超声提取30 min,补足失重,滤过,滤液通过0.45 μm 微孔滤膜,即得供试品溶液。

按照合剂制备方法,分别制备不含淫羊藿、菟丝子、沙苑子、知母、土茯苓的阴性样品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10、20 μL,注入液相色谱仪,以质量(μg)为横轴,峰面积为纵轴,计算线性回归方程。结果各成分的浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系,见表1。

表1 6 种成分的线性回归方程

2.4.2 进样精密度试验 精取混合对照品溶液10μL,按“2.1”项下色谱条件进样测定,重复进样6 次,测得淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.02%、2.00%、1.35%、0.33%、1.00%、0.05%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取20201208 批供试品适量,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别放置0、2、4、8、12、24 h 后进样检测,测得淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷的峰面积RSD(n=6)分别为1.38%、1.82%、1.26%、1.91%、1.57%、1.54%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取20201208 批供试品适量,共6 份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按照“2.1”项下色谱条件进样检测,测定6 种成分的色谱峰面积,计算淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷成分含量的RSD(n=6)分别为0.93%、0.79%、1.14%、3.27%、3.63%、0.93%,表明该实验重复性较好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取已知成分含量的同一批次供试品5.0 mL,共6 份,按已知含量100%的比例,加入混合对照品溶液2.0 mL(淫羊藿苷124.0 μg·moL-1、金丝桃苷188.8 μg·moL-1、沙苑子苷269.2 μg·moL-1、落新妇苷126.0 μg·moL-1、芒果苷96.8 μg·moL-1、宝藿苷172.4 μg·moL-1),按照“2.3”项下方法制备供试品溶液,以“2.1”项下色谱条件进样测定,计算回收率:回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%。

结果所测淫羊藿苷、金丝桃苷、沙苑子苷、落新妇苷、芒果苷、宝藿苷的平均加样回收率及RSD 分别 为100.01%(2.57% )、100.3%(2.32% )、99.58%(2.22%)、99.11%(1.08%)、96.92%(1.88%)、98.97%(0.62%)。

2.5 相对校正因子(fs/i)的建立与考察

药物在进行多成分含量测定时,通常以所含某一稳定、易得的成分对照品作为内参物,从而建立该内参与其它待测成分间的相对校正因子,其公式为:

注:fs/i为内参物s 对待测成分i 的校正因子,其中As为内参物对照品s 的峰面积或峰高,Cs为内参物对照品s 的浓度,Ai为某种待测成分对照品i 的峰面积或峰高,Ci为某种待测成分对照品i 的浓度。

取“2.2”项下混合对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,进样体积设置为2、4、6、8、10、20 μL,记录各对照品中各组分色谱峰的峰面积(A),根据公式fs/i=(Cs×As)/(Ci×Ai),以淫羊藿苷为内参物,分别计算落新妇苷、金丝桃苷、沙苑子苷、芒果苷、宝藿苷的相对校正因子,结果见表2。

表2 样品中待测成分的相对校正因子

2.6 不同仪器、色谱柱对fs/i 的影响

精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品溶液适量,按照“2.1”项下色谱条件进样检测,测定6 种成分的峰面积,对比考察Primaide 6000 型和Waters 2695 型2 种高效液相色谱仪的WondaSil C18Superb 5 μm(4.6 mm×250 mm)和Sepax Sapphire-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)2 种不同型号色谱柱对fs/i的影响,金丝桃苷、落新妇苷、沙苑子苷、芒果苷、宝藿苷的fs/i平均值分别为0.986 2、0.993 7、0.994 9、0.942 0、0.994 0;RSD 分别为1.63%、0.72%、0.62%、1.14%、0.69%,即不同仪器、不同色谱柱对所测成分的fs/i无显著影响,即fs/i不依赖于仪器及色谱柱。

2.7 待测成分色谱峰定位选择

HPLC-QAMS 法是对所含多个组分的中药及其制剂中有效成分同时测定的一种方法,该法是建立在对待测目标成分色谱峰准确定位的基础上,以内参物淫羊藿苷色谱峰为基准峰,采用相对保留时间值法对待测目标成分色谱峰进行定位,对比考察前述2 种不同仪器型号及色谱柱对金丝桃苷、落新妇苷、沙苑子苷、芒果苷、宝藿苷的相对保留时间值(RRT)的影响,平均值分别为0.4602、0.4769、0.6412、0.2237、1.2019min;RSD 分别为0.51%、1.32%、1.40%、2.75%、0.76%。

2.8 HPLC-QAMS 法与ESM 法含量测定比较

精密吸取3 个批次的供试品溶液各10 μL,按“2.1”项下色谱条件进样测定。采用HPLC-QAMS 法与ESM 法分别计算供试品中各待测成分的含量,结果见表3。

表3 两种方法测定样品中6 种成分的含量的比较(μg·mL-1)

3 讨论

3.1 指标成分的选择

一测多评法通过中药复方或中药材中有效成分间内在线性关系,以其中一种常见、易得的对照品做为内参物,通过建立的fs/i,对其他待测成分的含量进行同步测定。促育生精合剂由16 中药组方,成分复杂。结合中药质量标志物并遵循处方君臣佐使的配伍原则,分别选取合剂中君药淫羊藿所含主要成分淫羊藿苷和宝藿苷,臣药菟丝子、沙苑子所含主要成分金丝桃苷和沙苑子苷,佐药土茯苓、知母所含主要成分落新妇苷和芒果苷,作为定量指标成分,为有效评价合剂的整体质量提供参考依据。

3.2 待测成分色谱峰定位方式选择

在一测多评实验中,待测成分色谱峰的定位主要有两种方式:其一为相对保留值即利用待测成分与内参物的保留时间的比值并结合相关图谱进行色谱峰的定位;其二在相同的分析条件下,当色谱柱不同时,可利用待测成分的保留时间存在简单的线性关系进行测定[4]。第一种方法准确性高,第二种方法则可提高保留时间的重现性,目前QAMS 法多采用第一种方法进行色谱峰定位。本实验以淫羊藿苷的保留时间相对值作为待测成分的定位标准,以此计算不同的仪器和色谱柱的相对保留时间Ti/s(Ti/s=tR待测成分/tR淫羊藿苷)。结果在不同的色谱仪和色谱柱下,测得各待测成分的相对保留时间Ti/s无显著差异。

3.3 内参物的选择

促育生精合剂含有多种化学成分。根据补肾经、益精气的中医理论,淫羊藿补肾壮阳、祛风除湿,主治肾虚阳痿,精冷不育。淫羊藿常用于治疗肾病[5]、阳痿[6]等症。研究表明,淫羊藿总黄酮是淫羊藿最主要的活性成分,主要包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷、淫羊藿新苷A~E、去甲淫羊藿苷、淫羊藿脂素等,其中以淫羊藿苷为主要成分[7]。淫羊藿苷能增加机体心脑血管血流量、促进造血功能,并能调节机体内的激素,使其保持平衡状态,同时促进性腺的发育,对男性的生殖功能有重要作用[8,9]。研究表明,淫羊藿苷能改善血管性勃起功能障碍大鼠的勃起功能[10]。本实验考虑到淫羊藿苷作为补肾助阳要药,能够促进生殖系统的功能;同时淫羊藿苷在淫羊藿中含量相对较高,其对照品价廉易得,故选定淫羊藿苷作为内参物来计算其他5 个待测成分的含量。

综上,本研究首次建立了促育生精合剂中6 种成分的多指标质量评价模式,采用QAMS 法不仅达到了控制中药整体质量的目的,而且有效提高了中药质量控制的水平,降低了质量控制的成本。QAMS法操作方便、结果准确、重复性良好,可为促育生精合剂的质量控制提供参考。

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