抗栓胶囊中33 种禁用农药的残留量测定及风险评估*

程 妍，李 莉，张佳莉

常州市食品药品纤维质量监督检验中心,常州 213000

抗栓胶囊是由当归尾、壁虎、水蛭、马钱子、甘草、骨碎朴、穿山甲、丹参、土鳖虫、蜂房、人工麝香、土茯苓、乌梢蛇、僵蚕、蜈蚣、地龙、蟾酥、延胡索、虻虫等19 味中药组成，有活血化瘀、抗栓通脉的功效，用于血栓闭塞性脉管炎瘀血阻络症，对脑血栓、心肌梗塞、血栓性静脉炎等亦有较好的辅助治疗作用[1]。

由于野生资源的匮乏，需求量的增大，中药材的人工种植成为必然趋势。近年来，农药的使用量呈现上升的趋势，农药残留问题已引起国内外的普遍关注[2，3]。目前农药残留检测的方法在不断制定与完善中，对中药材及成药进行农药残留检测与筛查也是势在必行[4-6]。抗栓胶囊的制法为药材原粉直接投料，在成药中很可能会引入处方药材中所带入的农药残留，故有必要对中成药中的农药残留量进行监测。本研究参考《中国药典》2020 版四部2341 农药残留测定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法对33 种禁用农药残留量进行考察。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

液相色谱质谱联用仪（1290/6470A 安捷伦科技有限公司）；气相色谱质谱联用仪（7890B-7000D 安捷伦科技有限公司）；台式高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；分析天平（梅特勒托利多中国公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：33 种农药混合标准品，购于中国食品药品检定研究院，批号为610020-202001，含量见表6。内标：磷酸三苯酯，来源于BuPure，批号为C0007247，含量为1000 μg·mL-1。乙腈、甲酸、乙酸甲酸铵为色谱纯；水为超纯水。样品前处理使用的净化材料购自Waters 公司，Waters DisQue，批号为186008079，其组成为：无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）450 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，石墨化炭黑50 mg。29 批样品信息见表1。

表1 29 批样品信息

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1mm，2.7μm）；流动相A：0.1%甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸铵），流动相B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸铵）（95∶5），梯度洗脱（程序为30%B 0～1min，100% B 12～14min，30% B 14.1～17min）；柱温：40℃；流速：0.3 mL·min-1。

电喷雾（ESI）离子源，正离子扫描模式，监测模式为多反应监测（MRM）。毛细管电压：4 kV；干燥气温度：250℃；干燥气流速：8 L·min-1；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11 L·min-1；雾化器压力：310 kPa。各化合物监测离子对及质谱参数见表2。为了提高检测灵敏度，根据保留时间分段监测各农药。

表2 各农药化合物的LC-MS/MS 离子对及质谱参数

2.2 气相色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent DB-17MS（柱长为30 mm，柱内径为0.25 mm，膜厚度为0.25 μm）；进样口温度：250℃；不分流进样；载气：高纯氦气（He）；进样口：恒压模式；柱前压力：146 kPa。按表3 进行程序升温。

表3 检测程序升温

电子轰击源（EI），正离子扫描模式，监测模式为多反应监测（MRM）。离子源温度：250℃；碰撞气：氮气或氩气；质谱传输接口温度：250℃。各化合物监测离子对及质谱参数见表4。为了提高检测灵敏度，根据保留时间分段监测各农药。

表4 各农药化合物的GC-MS/MS 离子对及质谱参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品储备液 精密量取禁用农药混合对照品溶液（已标示各相关农药品种的浓度）1 mL，置20 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 气相色谱-串联质谱法所用内标溶液 取磷酸三苯酯对照品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含10 μg 溶液，即得。精密量取上述溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含0.1 μg 内标溶液。

2.3.3 空白基质溶液 空白基质样品为经检测不含待测禁用农药残留的抗栓胶囊样品。用溶剂配制混合对照品工作溶液作标准曲线，筛查不同厂家的样品，最终选择33 种农药均未检出的样品（哈尔滨B 公司，批号201102，编号10）作为空白基质样品。同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

2.3.4 基质混合对照品工作溶液 分别精密量取空白基质溶液1.0 mL（6 份），置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至约0.5 mL，分别加入混合对照品储备液10、20、50、100、200、500 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，即得。各化合物浓度信息见表5。

表5 各农药化合物的标准储备液及标准工作液浓度

2.3.5 供试品溶液 取供试品粉末（过3 号筛）3 g，精密称定，置50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%乙酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，加入乙腈15 mL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500 r·min-1）5 min，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（4∶1）7.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡（500 r·min-1）3 min，于冰浴中冷却10 min，离心（4000 r·min-1）5 min，取上清液9 mL，置预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（无水硫酸镁900 mg，N-丙基乙二胺450 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，石墨化碳黑50 mg）中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡（500 r·min-1）5 min使净化完全，离心（4000 r·min-1）5 min，取上清液，即得。

2.3.6 测定法 气相色谱-串联质谱法：分别精密吸取基质混合对照工作溶液、空白基质溶液和供试品溶液各1 mL，精密加入内标溶液0.3 mL，混匀，滤过，取续滤液，进样1 μL。

高效液相色谱-串联质谱法：分别精密吸取基质混合对照工作溶液、空白基质溶液和供试品溶液各1 mL，精密加入水0.3 mL，混匀，滤过，取续滤液，进样1 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性实验 取“2.3.4” 项下标准曲线第3个浓度点的工作溶液作为对照品溶液。另取空白基质样品适量，按“2.3.5”“2.3.6”项下方法，制成空白基质溶液。取空白基质溶液及对照品溶液，分别进样，记录色谱图，见图1、2。结果表明，空白基质对农药残留测定无干扰，专属性良好。

图1 空白基质溶液及对照品溶液LC-MS/MS 总离子流图

2.4.2 线性关系考察 取“2.3.4”项下标准曲线溶液，按“2.1”“2.2”项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（ng·mL-1）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，各成分在各自浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。以线性曲线第一浓度作为报告限，以《中国药典》2020版四部禁用农药检出限度作为定量限。线性关系等见表6。

2.4.3 重复性试验与加样回收率试验 取同一批33 种农药均未检出的样品（哈尔滨B 公司，批号201102，编号10）约3 g，精密称定，置50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，精密加入标准储备液750 μL，挥干溶剂，按“2.3.5”“2.3.6”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”“2.2”项下色谱与质谱条件测定，测得加样样品中的含量，计算回收率，结果表明该方法的加样回收率符合测定要求，见表6。

表6 线性关系、报告限、定量限、重复性与加样回收率（n=6）

2.5 样品含量测定

精密称取不同厂家不同批号的抗栓胶囊，按“2.3.5”“2.3.6” 项下方法，制备成供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，结果编号17 样品检出水胺硫磷0.027 μg·g-1，编号23 样品检出甲拌磷0.015 μg·g-1，编号1、13、14、20 样品检出氟虫腈，分别为0.016、0.046、0.042、0.012 μg·g-1，编号19、20、27、28、29 检出三氯杀螨醇0.139、0.124、0.083、0.083、0.064 μg·g-1，其余农药组分均未检出。

3 讨论

3.1 检测方法与色谱-质谱条件的选择

本研究参考了《中国药典》2020 版四部2341 农药残留测定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法对33 种禁用农药进行农药残留量的考察。前期在对药典方法进行转移验证时考察了不同色谱柱的分离效果，结果选用Agilent Poroshell 120 SB-C18液相色谱柱和Agilent DB-17MS 气相色谱柱。同时，对流动相比例与升温梯度进行了微调，结果发现，药典方法稳定可靠，基线平稳，保留时间合适，无基质干扰，适用于抗栓胶囊农残检测。

3.2 制备方法的选择

本研究参考了《中国药典》2020 版四部2341 农药残留测定法第五法，比较了多种制备方法。直接提取法虽较为简便，但缺少净化步骤，且抗栓胶囊有多达19 味药材，只经过提取就进样，干扰较大，污染较重。通过加样回收率试验，比较了快速样品处理法（QuEChERS）及两种固相萃取法，选用HLB固相萃取柱的固相萃取法，内吸磷回收率较低。选用氨基炭黑固相萃取柱的固相萃取法，内吸磷、蝇毒磷、甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆回收率较低。而快速样品处理法，所有农药化合物回收率均符合《中国药典》要求。因此本研究最终选择快速样品处理法作为供试品制备方法。

3.3 风险评估[7，8]

由于未有中药材农药残留风险评估的指导原则出台，故分别参照《食品中农药残留风险评估指南》和《中国药典》2020 版四部9302“中药有害残留物限量制定指导原则” 建立农药残留风险评估模型。

3.3.1 参照 《食品中农药残留风险评估指南》 按公式1 计算最大允许浓度，ADI 为每日允许摄入量（mg·kg－1）。

图2 空白基质溶液及对照品溶液GC-MS/MS 总离子流图

根据抗栓胶囊说明书最大服用剂量为每日口服一次8 粒，一日3 次，每粒为0.3 g，日最大服用剂量为7.2 g 计算。

3.3.2 参照《中国药典》2020 版四部 按公式2 计算：

L 为最大限量理论值（mg·kg－1）；A 为每日允许摄入量（mg·kg－1）；W 为人体平均体质量（kg），一般按63 kg 计；M 为每日人均可服用的最大剂量（kg），抗栓胶囊M 按日最大服用剂量为7.2 g；AT 为平均寿命天数，一般为365 天·年－1×70 年；EF 为中药服用频率（天·年－1），设为每年90 天；ED 为一生服用中药的暴露年限，设为20 年；t 为农药的转移率（%），中成药t 为100%；100 为安全因子，表示每日由中药中摄取的农药残留量不大于日总暴露量（包括食物和饮用水）的1%。

表7 显示，抗栓胶囊中残留农药水胺硫磷、甲拌磷、氟虫腈和三氯杀螨醇含量极低，远远低于《中国药典》2020 版四部和《食品中农药残留风险评估指南》规定的限度，可为厂家对产品进行农药残留风险评估提供方法参考。

表7 样品农药残留风险评估结果

3.4 结果分析

由测定结果可知，部分批次抗栓胶囊样品中检出部分农药残留，包括1 批号水胺硫磷，1 批号甲拌磷，4 批号氟虫腈，5 批号三氯杀螨醇，检出率分别为3.4%、3.4%、13.8%、17.2%，其中2 批号氟虫腈超出《中国药典》2020 版四部禁用农药检出限度。

本研究参考了《中国药典》2020 版四部2341 农药残留测定法第五法，采用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 法对33 种禁用农药进行农药残留量进行监测。结果显示，该方法操作简单、检测快速、灵敏度高、重复性好，可用于抗栓胶囊的农药残留筛查。因LC-MS/MS 法检测化合物灵敏度较高且不易有假阳性干扰，故同时可以用GC-MS/MS 和LC-MS/MS 检测的化合物，以LC-MS/MS 检测数据为主，必要时参考GC-MS/MS 数据。

本方含有19 味中药，其中植物药有当归、丹参、马钱子、甘草、茯苓、延胡索和骨碎朴。通过查询相关文献及相关报道，针对药典规定的禁用农药，依旧在某些中药材中，会出现部分农药易超标的情况。针对抗栓胶囊而言，其中当归、丹参、甘草、延胡索均有检出禁用农残的报道。当归有报道可能检出甲拌磷、克百威、甲胺磷、氟虫腈、涕灭威、灭线磷等；丹参有报道可能检出总滴滴涕、硫丹、氟虫腈等；甘草有报道可能检出甲拌磷等；延胡索有报道可能检出氟虫腈等。中药材农药残留超标问题较为严重，需要种植者及厂家严正关注，尽可能减少农残超标的情况。