基于网络药理学预测和验证当归芪枣精“一方多效”的作用机制*

张 雷，朱 卫，黄 豫

昆山市中医医院，昆山 215300

当归芪枣精为本院临床验方，在当归补血汤基础上加大枣而成，功能养血、活血、益气，用于气血两虚、疲倦乏力、久病体虚等症，临床应用多年且疗效确切[1]。现代研究明确了当归补血汤的物质基础，发现了其促进造血、调节免疫、保护心脑血管等作用，可用于治疗多种原因所致的贫血、动脉粥样硬化及肿瘤等疾病[2，3]。但是，在经方基础上加味使用，能否起到增效的目的，是否有扩大临床适应症的可能，其内中具体的药理机制仍需从整体水平上加以阐释[4]。

网络药理学基于“药物-靶点-疾病”网络，能够系统反映中药复方互相作用的特点，体现多组分、多靶点、多途径的优势[4，5]；同时，部分功能蛋白可在多个疾病中起到中枢（Hub）调控作用，由此涉及多条信号通路，这与中医药“同病异治”和“异病同治”理论相契合，有利于推动医院制剂的二次开发研究[6]。

为明确当归芪枣精有效成分的作用靶点，预测其可能作用的疾病群，本研究利用网络药理学方法来探讨其复杂多样的作用机制；同时，建立放血和环磷酰胺并用的气血双虚小鼠模型，验证其气血双补的作用机理，为该药的进一步开发提供理论参考[5，7]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Mini protean 3 cell 型电泳仪Gel Doc2000 型凝胶成像仪、电泳槽（美国Bio-Rad 公司）；TE77XP电转仪（HOEFER）；1-15K 高速冷冻离心机（Sigma公司）；GB-50 隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

当归芪枣精浓缩液（昆山市中医院制剂室生产，1 g·mL-1）；放射免疫沉淀法裂解液（RIPA）、电泳缓冲液、磷酸盐缓冲液（PBS）、硝酸纤维素膜（NC 膜，北京索莱宝科技有限公司，批号分别为R0020、T1010、P1010、HATF00010）；BCA 蛋白定量试剂盒（美国HyClone 公司，批号ABA212020）；丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、p-MAPK 抗体（Bioss，批号分别为bsm-33423M、bs-5476R）；信号转导转录激活因子1（STAT1）、表皮生长因子受体（EGFR）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Abcam，批号分别为AB155933、AB32077、AB9485）；辣根过氧化物酶（HPR）标记山羊抗兔IgG 二抗（碧云天，批号A0208）。

雄性小鼠，无特定病原体级（SPF 级），体质量（20±2）g，由卡文斯百格（苏州）模式动物研究有限公司提供（许可证号: SCXK（苏）2018-0002）。

1.2 成分与疾病筛选

为明确当归芪枣精（当归、黄芪、大枣）的所有活性成分，利用中药系统药理学平台（http://tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）进行检索，筛选条件为脂水分配系数对数值（ALogP）＜5 和类药性（DL）≥0.18，去重后即得活性成分及对应疾病。

1.3 成分与疾病的靶点预测

基于TCMSP 数据库，将“1.2”项获得的成分依次映射潜在靶点，再将其蛋白编号导入UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/），筛选条件为“homo sapiens”；将疾病导入基因数据库（http://www.genecards.org/）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://www.omim.org/），两者合并去重即得疾病对应的靶点[8]。

1.4 靶点相互作用网络及Hub 蛋白提取

借助Venny 2.1 软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）制作韦恩图，交集部分即为疾病与成分的共同靶点[9]。将共同靶点输入到STRING 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）中，限定物种为homo sapiens，获得蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络[10]。将PPI 数据导入Cytoscape3.7.2 中，通过MCODE 插件进一步获取Hub 蛋白[4]。

1.5 GO 与KEGG 通路富集分析

将“1.4”项交集靶点输入到STRING 数据库，选择分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组成（CC）条目进行基因本体富集（Gene Ontology，GO），并以校正adj P ≤0.05 为条件进行基因组的京都百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并依各条目靶点数降序排列，利用R3.6.3软件（https://cran.r-project.org/mirrors.html）进行可视化展示[10]。

1.6 成分-靶点-疾病网络构建

分别将交集靶点与其相关联的成分、疾病构建靶点-成分、靶点-疾病网络，再利用Cytoscape 3.6.0 软件将两者网络合并，从而得到成分-靶点-疾病网络图[11]。

1.7 实验分组与造模

雄性小鼠24 只适应性饲养3 d 后，随机分为4组：正常组（A 组）、模型组（B 组）、当归芪枣精低剂量（C 组，成人等效剂量）和高剂量组（D 组）；每组6只。其中，B、C、D 组小鼠在第3、5、7 d 经腹腔注射环磷酰胺80 mg·kg-1（给药体积为8 mL·kg-1），并同步剪尾失血0.5 mL，建立气血双虚模型[12，13]。从第1 d至第7 d，C 组小鼠灌胃当归芪枣精4.0 g·kg-1；D 组灌胃当归芪枣精8.0 g·kg-1；A 组和B 组小鼠灌胃生理盐水25 mL·kg-1；每日1 次。24 h 后所有小鼠眼眶取血100 μL，离心并取上清液于-80℃冰箱保存；麻醉处死，收集的骨髓组织保存于4℃冰箱。

1.8 Western Blot（WB）法检测骨髓中STAT1、EGFR、MAPK 和p-MAPK 蛋白的表达

每组约取出100 mg 小鼠骨髓组织置于2 mL EP 管中，依照说明书加入RIPA 高效蛋白裂解液（含2 μL PMSF 和2 μL 磷酸酶抑制剂），制备匀浆后离心取上清液。用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，取适量的蛋白质样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并使用湿转移法转移到NC 膜上，该膜再用TBST 冲洗3 次[12]。STAT1、EGFR、MAPK 和p-MAPK（1∶1000 Proteintech）一抗在4℃下过夜，全蛋白以GAPDH 作为内对照；次日，用HPR 标记的二抗（1∶5000）荧光标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000 Licor）室温避光孵育2 h，再用TBST 冲洗3 次，化学凝胶成像系统扫描，用ImageJ 分析软件进行定量[14]。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 化合物与疾病靶点

以设定条件在TCMSP 数据库收集得到当归化合物5 个及其对应的59 种疾病，黄芪化合物40 个及其对应的469 种疾病，大枣化合物61 个及其对应的440 种疾病，并收集后得到53 个化合物和307种疾病。再利用TCMSP 和UniProt 数据库搜索得到253 个化合物预测靶点，Gencards 数据库检索到48个疾病潜在靶点，OMIM 数据库检索到153 个疾病对应靶点，并集后得到189 个疾病预测靶点。

2.2 靶点相互作用网络结果

比对化合物与疾病预测靶点，筛选出共同靶点110 个并绘制Venn 图（见图1）。将交集靶点导入STRING 数据库建立PPI 网络（见图2），线条越粗表示靶点间的关联度越大[14]；利用Cytoscape3.7.2 的MCODE 插件筛选出Hub 蛋白，其中以视网膜母细胞瘤基因（RB1）、EGFR、雌激素受体1（ESR1）、细胞色素A1（CYP1A1）、趋化因子（C-X-C 基元）配体11（CXCL11）、丝蛋白（SI）、CYP2B6、人丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、溶质载体家族6 成员2（SLC6A2）的关联性最强，提示这些高连通蛋白可能是当归芪枣精发挥生物学效应的关键靶点。

图1 疾病-药物共同靶点韦恩图

图2 靶点蛋白交互网络图

2.3 GO 生物过程富集结果

在STRING 数据库中，对PPI 网络中得到的共同靶点进行GO 功能富集分析，共得到2606 个GO条目，颜色越深表示富集度越显著，主要包含2333个生物过程（BP）的条目，172 个分子功能（MF）的条目，101 个细胞组成（CC）的条目[13]，主要参与营养水平反应、脂多糖应答、类固醇激素反应、对细菌来源分子的反应、活性氧代谢过程、抗生素反应、对外来刺激的反应、氧含量反应、对活性氧的反应、对金属离子的反应等，见图3。

图3 基因本体富集条形图

2.4 KEGG 通路富集分析

利用STRING 数据库对PPI 网络中110 个靶蛋白基因进行分析，共富集到170 条生物通路，主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末化产物及晚期糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）、白介素17（IL-17）、缺氧诱导因子1（HIF-1）和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等，表明当归芪枣精可通过细胞增殖与凋亡、抗炎、抗病毒、抗氧化应激等作用发挥治疗效果。根据P 值排序的前20 个通路图（见图4），颜色越红代表显著性越明显，气泡越大说明富集到的基因数目越多。考虑到EGFR 级联是细胞内重要的跨膜信号转导系统，其主要通过细胞外调节激酶（ERK）/MAPK、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K/Akt）、Janus 激酶/信号转导及转录激活蛋白（JAK/STAT）通路将信号从胞质传导到细胞核，进而调控各种转录因子和其他胞内蛋白的活性而发挥作用，结合Hub蛋白分析结果，故选择EGFR、STAT1、MAPK 及其磷酸化蛋白的表达予以验证[15]。

图4 KEGG 通路富集气泡图（前20）

2.5 成分-靶点-疾病网络构建

以成分与靶点、疾病的交互关系构建网络（见图5），表明当归芪枣精的活性成分作用于各自不同的靶点，从而调控错综多样的信号通路，发挥“一方多效”的作用。就成分而言，Degree 前5 的化合物为槲皮素（quercetin）、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、山柰酚（kaempferol）、光千金藤碱（stepharine）、黄豆苷元（daidzein）；就靶点而言，Degree前10 的蛋白为过氧化物合酶2（PTGS2）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）、花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白（ALOX5）、雌激素受体1（ESR1）、β2 肾上腺素能受体（ADRB2）、心脏钠通道基因（SCN5A）、细胞色素P450 1A2（CYP1A2）、谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）、肿瘤坏死因子超家族成员15（TNFSF15）、环加氧酶1（PTGS1）；就疾病而言，Degree 前10 的疾病为非特异性癌症、疼痛、阿尔茨海默病、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、帕金森病、哮喘、炎症、肺癌。

图5 “成分（紫色）-靶点（黄色）-疾病（蓝色）”网络图

2.6 当归芪枣精对EGFR/MAPK/STAT1 通路蛋白调控的影响

WB 法检测结果显示，与正常组比较，模型组小鼠骨髓中EGFR、STAT1 表达和p-MAPK/MAPK 比例显著降低（P ＜0.05）；与模型组相比，当归芪枣精高剂量组小鼠EGFR、STAT1 表达和p-MAPK/MAPK 比例显著升高（P ＜0.05），低剂量组仅EGFR、STAT1 表达升高（P ＜0.05），p-MAPK/MAPK 比例呈剂量依赖性上调，且低、高剂量组有显著差异（P ＜0.05）。见图6、表1。

图6 各组小鼠骨髓中EGFR/MAPK/STAT1 通路蛋白免疫印迹检测结果

表1 各组小鼠骨髓中EGFR/MAPK/STAT1 通路蛋白的表达（，n=6）

表1 各组小鼠骨髓中EGFR/MAPK/STAT1 通路蛋白的表达（，n=6）

3 讨论

气血两虚证可见于癌症、手术后、贫血等多种疾病症候，本研究借助网络药理学复杂而可视化的信息关联注释，系统观察了化合物、蛋白、疾病之间多样化的干预与影响[4]。结果显示，槲皮素、山柰酚、黄豆苷元匹配到较多靶点。研究表明，槲皮素和山柰酚具有清除氧自由基、抗氧化的功能[16]，前者还能改善血流动力学紊乱、疲乏活动、耐量下降[17]和气道炎症[18]，促进肿瘤细胞凋亡[19]；大豆苷元则能抗氧化、防止血管增生、抗炎、抑制癌细胞增殖[20]。结合成分-靶点-疾病和PPI 网络分析发现，PTGS2、PPARG、ESR1、EGFR 等是关键靶点，这充分体现了当归芪枣精多成分、多靶点协同增效的作用特点，可能也是其发挥补气养血作用的原因所在[4]。

同时，从成分-靶点-疾病网络可以看出：1 个靶蛋白可以与许多疾病相关，如EGFR、PTGS2 等；也有一个靶点与一种疾病相关的，如细胞周期检测点激酶1（CHEK1）、类视黄酸受体alpha（RXRA）与凝血因子VII（F7）。作为degree 值最大的靶点，PTGS2与32 种疾病均相关，如炎症、疼痛、心血管疾病等，这也与其现代药理实验结论相吻合[21-23]；又如PPARG 是重要的细胞分化转录因子，主要控制脂肪细胞的分化代谢。本研究发现其与炎症反应、银屑病、肥胖症、糖尿病、自身免疫性疾病、缺血性心脏病、动脉硬化等有密切关系[24，25]；但从整个网络来看，疾病主要富集于癌症。恶性肿瘤多因气血不足、运行不畅而生，手术和放、化疗会进一步导致气血亏虚，形成因虚致实、因实生虚的现象，进而演变为气血两虚证候，而中医药在改善免疫功能、减少并发症等方面取得了不错的效果[26，27]。推测当归芪枣精或可作为防治癌症的药物，而靶点和疾病表现出的复杂相互作用模式，也为中医“异病同治”理论提供了证据，即多靶点-多疾病的复杂机制[4]。

GO 富集分析发现，当归芪枣精的候选化合物所匹配的靶点蛋白功能主要包括细胞增殖凋亡、转录翻译、信号转导和应激反应等。KEGG 富集分析结果显示，当归芪枣精多靶点映射于不同通路，主要介导癌症、HIF1、IL-17、TNF 信号通路等发挥作用。为探索当归芪枣精补气养血的机制，本研究通过建立气血两虚小鼠模型，选取作用于EGFR 级联通路的关键靶点EGFR、STAT1、MAPK 及p-MAPK 来进行验证。EGFR 是一种跨膜糖蛋白受体，多表达于哺乳动物的细胞膜，由表皮生长因子激活后将不同的信号刺激传入细胞内，激活下游ERK/MAPK、PI3K/Akt、JAK/STAT 等多种信号转导途径，在细胞增殖分化和肿瘤发生中发挥重要作用[28，29]。MAPK 是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要信使，激活后能调节细胞的增殖、分化和凋亡过程，从而有效控制细胞的生长[30]。作为一种信号转导和转录活化因子蛋白，STAT 是重要的胞质转录因子，而STATs 家族成员之一的STAT1 被酪氨酸激酶JAK 和MAPK 激活后，其C 端激活保守的酪氨酸和丝氨酸残基磷酸化，形成二聚体后易位进入细胞核后调节靶基因，从而促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、减弱肿瘤的迁移和侵袭等作用[31]。表明这些靶点通过一系列级联反应在炎症免疫、细胞凋亡等方面发挥作用。结果显示，模型组小鼠骨髓中EGFR、STAT1 表达和p-MAPK/MAPK 比例明显降低（P<0.05），当归芪枣精高剂量组EGFR、STAT1 表达和p-MAPK/MAPK 比例显著升高（P<0.05），且在调高p-MAPK/MAPK 比例上与低剂量组有显著差异（P<0.05）。由此可见，当归芪枣精可呈剂量依赖性上调p-MAPK/MAPK 比例，也可上调EGFR、STAT1 的表达，通过调控EGFR 信号转导通路的级联蛋白表达，发挥补气养血的作用，这进一步证实了网络药理学预测的当归芪枣精可能的分子机制[32]。

综上所述，本研究以网络药理学方法预测了当归芪枣精在神经系统、呼吸系统疾病，癌症等疾病上的不同治疗价值，较为系统地阐释了当归芪枣精多成分、多靶点、多途径协同作用的多维药理机制。此外，动物模型验证表明，当归芪枣精可以激活EGFR/MAPK/STAST1 信号通路，调节细胞增殖和凋亡关键蛋白的表达，为拓展其临床应用提供了新的线索[33]。