葛根与茶多酚体内外协同辅助降血糖活性探究

袁传勋，王津坤，金日生，王敏，李亮

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009）

糖尿病是世界上最常见的代谢紊乱疾病之一，其主要特征是胰岛素分泌减少或胰岛素抵抗引起的高血糖[1-2]，糖尿病已成为世界第五大死亡原因，国际糖尿病联合会预测，到2035年，全世界将有5.92亿人患糖尿病[3]，糖尿病在引起高血糖的同时还会引起糖尿病肾病、糖尿病相关心脏疾病、糖尿病神经病变和糖尿病足等多种并发症[4]。现如今糖尿病高血糖的控制方法主要为口服药物，但长期服用口服降糖药可能会产生副作用，如阿卡波糖会引起胃肠道疾病、格列本脲会引起粒细胞减少和低血糖症、二甲双胍会引起乳酸酸中毒。药食同源的中药除了具有保健效果外，还具有不良反应较少的优点[5]，在治疗慢性病等领域具有广泛的前景。

葛根既是食材又是药材，产地广泛，在古代就是治疗糖尿病（消渴症）的主要药材之一[6]，其具有多种功效，如解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻等[7]。葛根异黄酮是葛根的主要活性成分，研究表明葛根异黄酮在解酒、护肝、抗氧化、降血糖与降血脂等多方面都具有活性[8-9]。茶多酚是绿茶中的主要活性成分，其中大部分是儿茶素及其衍生物，研究表明其具有广泛的药理作用诸如减肥、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌、抗炎抑菌等[10-11]。韦芳媚等[12]对桑叶提取物与茶多酚的协同降血糖与协同抗氧化作用进行研究，结果表明桑叶提取物与茶多酚在对糖尿病关键酶的抑制作用优于两种成分单独作用，为植物提取物应用于功能性茶饮料提供了参考；赵磊等[13]将南瓜、山药、葛根与桑叶复配研究对糖调节受损改善作用，结果表明配方可从改善糖代谢、脂代谢、氧化应激等多种途径预防小鼠因高糖引起的糖调节受损。本文研究了葛根提取物与茶多酚在体外对α-葡萄糖苷酶协同抑制效果及体内对2型糖尿病小鼠协同治疗的效果，为葛根提取物与茶多酚复配应用于辅助降血糖功能性食品的开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物

5周龄雄性昆明小鼠：SPF级，安徽医科大学。

1.1.2 试剂

绿茶提取物：圣嘉德生物科技有限公司；葛根提取物：上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶：西格玛-奥德里奇（上海）贸易有限公司；对硝基苯-α-D-葡萄糖苷 （＞99%）（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）：上海麦克林生化科技有限公司；阿卡波糖：中美华东制药有限公司；链脲佐菌素（≥98.00%）：翌圣生物科技有限公司；盐酸二甲双胍：北京圣永制药有限公司；小鼠胰岛素酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）测定试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅（BSG-26）：上海一恒科学仪器有限公司；电子天平（ATY124）：力辰仪器有限公司；紫外-可见光分光光度计（UV-1800PC）：翱艺仪器有限公司；血糖仪（悦准Ⅱ型306）：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；全波长酶标仪（Varioskan Flash）：赛默飞世尔科技；台式高速离心机（TG16-WS）：湖南湘鑫仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根提取物与绿茶提取物中有效成分含量测定

1.3.1.1 葛根异黄酮含量测定

采用紫外-分光光度法对葛根提取物中葛根异黄酮的含量进行测定[14]。将4.0 mg葛根素标准品用70%乙醇溶液溶解于10 mL容量瓶中，配制成0.4 mg/mL的葛根素标准溶液作为母液。再分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL母液，用70%乙醇溶液定容于25 mL容量瓶中，配制成梯度浓度为 3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 μg/mL的系列工作液，以70%乙醇作为空白对照，在250 nm处测定吸光度，以葛根素浓度（μg/mL）为X，吸光度为Y，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=0.056 15X-0.015 05，R2=0.999 6。

取10.0mg样品溶于50mL70%乙醇中，吸取1.0mL，再溶于50 mL 70%乙醇中，在250 nm处测定吸光度，并通过以上标准曲线计算样品中葛根异黄酮含量。

1.3.1.2 茶多酚含量测定

采用酒石酸亚铁法对样品中茶多酚含量进行测定[15]。配制梯度浓度的茶多酚标准品溶液，并取1 mL茶多酚溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亚铁溶液与4 mL去离子水，再用pH6.9的磷酸缓冲液定容至25 mL，在540 nm处对吸光度进行测定，以茶多酚浓度（mg/mL）为X，吸光度为Y，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=0.331 8X+0.003 3，R2=0.999 8。

取200 mg样品，用去离子水定容至100 mL作为样品溶液，取1 mL样品溶液在25 mL容量瓶中加入5 mL酒石酸亚铁溶液与4 mL去离子水，并用pH6.9磷酸缓冲液定容至25 mL，在540 nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算出样品中茶多酚的含量。

1.3.2 体外降血糖协同效果的探究

1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶活性的抑制

参考文献[16]的方法并略作修改。加入100 μL不同浓度的样品溶液及100 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃预热 20 min后，加入 100 μL p-NPG，在 37℃下反应30 min，加入500 μL Na2CO3溶液终止反应，加入500 μL pH6.8磷酸缓冲液后，在405 nm下测定吸光度，记为A样品。以缓冲液代替样品溶液，作为对照组，测量吸光度记为A对照；以缓冲液代替酶溶液，作为背景组，测量吸光度记为A背景；以缓冲溶液替代酶溶液和样品溶液，作为空白组；以阿卡波糖溶液替代样品溶液，作为阳性对照组。抑制率的计算公式如下。

1.3.2.2 葛根提取物与茶多酚半抑制浓度（50%inhibiting concentration，IC50）

配制梯度浓度的葛根提取物溶液与茶多酚溶液，按1.3.2.1方法进行不同浓度样品α-葡萄糖苷酶抑制率的测定。葛根提取物与茶多酚的浓度与其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均具有剂量-效应关系，符合中效原理，参照Chou与Talary公式[17]，其中样品浓度记为D，抑制率为50%时的样品浓度记为Dm，D浓度时的抑制率记为fa，m为剂量-效应曲线的系数，其对数形式如下。计算出抑制率为50%时的浓度，即IC50。

1.3.2.3 最佳协同抑制质量比

将茶多酚与葛根提取物分别按质量比 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 进行复配，并参照 1.3.2.1 方法对 α-葡萄糖苷酶活性的抑制率进行测定。

1.3.2.4 联合指数的测定

联合指数（combination index，CI）是评价药物协同效果的一个指标[18]，两种药物分别记作药物1与药物2，其中药物1单独作用时抑制率为50%的浓度为（D）1，药物2单独作用时抑制率为50%的浓度为（D）2，药物1与药物2联合作用时抑制率为50%的各自的浓度分别为（D）x1与（D）x2，CI的计算方法如下。当CI值＞1.1时，两种物质呈拮抗效果；CI值介于0.9与1.1之间时，两种物质呈现相加效果；CI值＜0.9时，两种物质呈协同效果。

按1.3.2.3中最佳质量比配制梯度浓度溶液，并计算两种物质复配时各自的IC50，并代入上述式中计算，得到葛根提取物与茶多酚的CI，并根据CI值判定葛根提取物与茶多酚对α-葡萄糖苷酶体外抑制是否具有协同作用。

1.3.3 体内辅助降血糖协同效果的探究

1.3.3.1 2型糖尿病小鼠模型的建立及分组给药

56只小鼠以每组8只分为7组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、葛根提取物组、茶多酚组、低剂量协同组、高剂量协同组。适应性喂养1周后，除空白组外，其余各组改用高脂饲料（胆固醇1%、猪油8%、蛋黄粉5%、蔗糖10%、基础饲料76%）喂养，喂养期间自由饮水进食。在高脂饲料喂养4周后用1%链脲佐菌素溶液按40 mg/kg剂量腹腔注射进行2型糖尿病建模（空白组注射生理盐水作为对照），连续注射4 d后进行空腹血糖测定，空腹血糖值大于11.1 mmol/L[19]即为造模成功。各小组成功造模后进行灌胃给药。空白组与模型组使用蒸馏水灌胃、阳性对照组使用150 mg/kg盐酸二甲双胍灌胃进行给药、葛根提取物组灌胃400 mg/kg葛根提取物、茶多酚组灌胃200 mg/kg茶多酚、协同低剂量组灌胃200 mg/kg葛根提取物与100 mg/kg茶多酚、协同高剂量组灌胃400 mg/kg葛根提取物与200 mg/kg茶多酚。连续灌胃给药4周后，乙醚麻醉，摘除眼球取血后断颈处死。

1.3.3.2 小鼠体质量及空腹血糖测定

在饲养过程中，每周进行体质量与空腹血糖的测量，测量均在断食不断水12 h后进行，空腹血糖采用尾端取血方法进行测定。

1.3.3.3 小鼠糖耐量指标

处死前断食12 h后对各组小鼠的空腹血糖进行测定，然后对各组小鼠灌胃2 g/kg bw葡萄糖溶液，于灌胃后0.5、1.0、2.0 h测定小鼠血糖，采用梯形面积法[20]计算糖耐量曲线下面积（area under curve of glucose，AUC）并比较各组小鼠间AUC的差异。

式中：a为0 h血糖值，mmol/L；b为0.5 h血糖值，mmol/L；c为 1h血糖值，mmol/L；d为2h血糖值，mmol/L。

1.3.3.4 对小鼠血清胰岛素含量的影响

小鼠眼球血在4 000 r/min下离心5 min，得到小鼠血清。使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒对小鼠血清中胰岛素（insulin，INS）含量进行测定，操作方法参照试剂盒说明书。

1.3.3.5 对小鼠稳态模型胰岛素抵抗指数与稳态模型胰岛素分泌指数的影响

除了INS值外，对小鼠糖尿病情况的判断还需要结合空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）值通过以下两个公式进行计算分析。

其中，稳态模型胰岛素抵抗指数[21]（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）的计算公式如下。

稳态模型胰岛素分泌指数[22]（homeostasis model assessment-β，HOMA-β）的计算公式如下。

根据1.3.3.2方法与1.3.3.4方法中得到的FBG与INS进行计算，得到小鼠HOMA-IR与HOMA-β值。

1.4 数据处理与分析

使用SPSS 26.0进行显著性分析。使用Excel 2017与Origin 2018对数据处理及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 原料中主要成分含量的测定

2.1.1 葛根异黄酮含量的测定

通过标准曲线计算得出葛根提取物样品中葛根异黄酮的含量为（51.60±0.45）%。

2.1.2 茶多酚含量的测定

通过标准曲线计算得出绿茶提取物样品中茶多酚的含量为（81.33±0.12）%。

2.2 葛根提取物与茶多酚体外辅助降血糖效果的验证

2.2.1 葛根提取物与茶多酚IC50结果

茶多酚、葛根提取物与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果的剂量-效应曲线分别如图1～图3所示。

由图1和图2可知，茶多酚与葛根提取物对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，其抑制效果均随样品浓度的增大而逐渐增加，直到接近完全抑制。根据计算，茶多酚对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.1159μg/mL，而葛根提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50为1.000 μg/mL。同时对阳性对照物阿卡波糖进行测定，结果测得阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50为61.781 μg/mL，说明单独使用时，葛根提取物与茶多酚均具有良好的体外降血糖活性。

2.2.2 葛根提取物与茶多酚最佳复配质量比的确定

葛根提取物与茶多酚不同质量比复配下对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率如图4所示。

由图4可知，当葛根提取物与茶多酚的质量比为2∶1时，对α-葡萄糖苷酶抑制率最高，可达到（88.65±1.91）%。因此将2∶1作为后续试验中葛根提取物与茶多酚复配时的质量比。

2.2.3 葛根提取物与茶多酚CI值的测定

在保持葛根提取物与茶多酚的质量比为2∶1条件下，配制梯度浓度溶液进行抑制α-葡萄糖苷酶试验，得到的剂量-效应曲线如图5所示（以茶多酚浓度计）。

由图5可知，葛根提取物与茶多酚在进行复配时的 IC50分别为 0.133 1 μg/mL 与 0.066 55 μg/mL，并计算出CI为0.707 3，小于0.9，说明葛根提取物与茶多酚在α-葡萄糖苷酶活性的抑制上具有良好的协同效果。葛根异黄酮与茶多酚均属于多酚类物质，其代表性结构为苯环与杂环六元吡喃或吡喃酮缩合，并在吡喃环或吡喃酮上有苯环作为取代基。多酚可以通过与酶结合，占据底物结合位点或结合后改变酶的构象，使底物无法与酶结合，达到对酶活性的抑制。茶多酚与葛根异黄酮中苯环上具有多处酚羟基取代，可以通过范德华力或疏水键等与α-葡萄糖苷酶上不同的位点相结合，进而达到对酶活性的协同抑制作用[23]。

2.3 葛根提取物与茶多酚协同体内辅助降血糖效果的验证

2.3.1 小鼠体质量与空腹血糖变化

2.3.1.1 小鼠体质量变化

实验期间，小鼠体质量变化情况如图6所示。

由图6可知，在适应性喂养与高脂饲料喂养期间，各组小鼠的体质量逐渐增长，空白组由于使用普通饲料进行喂食，其体质量低于其他喂食高脂饲料的各组。经过造模与灌胃给药后，空白组的体质量持续升高，其他各组小鼠的体质量均有明显下降，以模型组小鼠的体质量下降最为显著，各给药组相对与模型组消瘦情况均有一定的改善，茶多酚对糖尿病小鼠的消瘦情况改善效果最弱，而经过与葛根提取物复配后，对糖尿病小鼠消瘦改善效果增强。

2.3.1.2 小鼠空腹血糖变化

实验期间，小鼠空腹血糖变化情况如图7所示。

各组小鼠在适应性喂养与高脂饲料喂养期间的空腹血糖保持在稳定状态。由图7可知，建模后，除空白组外，各组小鼠的空腹血糖均超过了11.1 mmol/L，表明建模成功。在灌胃给药过程中，空白组小鼠空腹血糖小于11.1 mmol/L，处于正常范围内，模型组小鼠空腹血糖大于11.1 mmol/L，无下降趋势，而阳性对照组、葛根提取物组、茶多酚组、协同低剂量组与协同高剂量组小鼠空腹血糖在灌胃给药4周过程中均呈下降趋势，说明葛根提取物与茶多酚对小鼠血糖均具有辅助下调效果。相对于使用单组分进行灌胃给药，协同高剂量组小鼠空腹血糖的下降趋势更加明显，当灌胃4周后其空腹血糖平均值小于11.1 mmol/L，恢复到正常水平，说明茶多酚与葛根提取物对糖尿病小鼠具有协同治疗效果。

2.3.2 对小鼠AUC的影响

各组小鼠AUC计算结果如图8所示。

由图8可知，对小鼠的糖耐量实验中，各灌胃给药组小鼠的AUC均大于空白组，但均小于模型组，与空白组、模型组比较均具有极显著性差异（p＜0.01），在各给药组中，协同高剂量组小鼠的AUC值最低。AUC反映了小鼠对葡萄糖的耐受情况，是糖尿病考察的重要指标。结果表明茶多酚与葛根提取物对糖尿病小鼠糖代谢紊乱具有改善效果，茶多酚与葛根提取物复配后对糖尿病小鼠糖代谢紊乱具有协同改善效果。糖耐量除受到肠道内α-葡萄糖苷酶等双糖酶活性的影响外，还受到体内INS分泌量、机体胰岛素抵抗等多方面因素影响，因此需要结合INS分泌量进行进一步分析[24]。

2.3.3 对小鼠血清胰岛素含量的影响

对小鼠的INS测定结果如图9所示。

由图9可知，空白组的INS分泌含量最低，建模后，各组小鼠的INS均增加，给药后各组的INS分泌量进一步上升，而协同高剂量组的INS含量最高，与模型组具有显著差异（p＜0.05），其次为茶多酚组，其余各组INS含量相差不大。INS分泌量受到胰岛β细胞损伤情况与胰岛素抵抗等多种因素影响，因此需要引入HOMA-IR与HOMA-β等稳态模型对小鼠糖尿病情况进一步分析。

2.3.4 对小鼠HOMA-IR与HOMA-β的影响

小鼠HOMA-IR计算结果如图10所示。

由图10可知，小鼠在建模后出现胰岛素耐受情况。在灌胃给药后，茶多酚组HOMA-IR与模型组无显著性差异，说明单独使用茶多酚改善模型小鼠的胰岛素耐受不明显（p＞0.05）。其余各给药组HOMA-IR均小于模型组且具有显著差异（p＜0.05），在各给药组中，协同高剂量组小鼠HOMA-IR值最低，说明除茶多酚组外，其他各给药组小鼠的胰岛素抵抗情况均有明显改善，而葛根提取物与茶多酚的高剂量协同对糖尿病小鼠的胰岛素抵抗情况改善效果最佳。同时，可通过HOMA-β分析糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤是否得到修复。

小鼠HOMA-β结果如图11所示。

由图11可知，模型组HOMA-β极显著低于空白组（p＜0.01），说明建模后小鼠胰岛β细胞功能受到了损伤。经过灌胃投药后，各投药组小鼠HOMA-β相较于模型组均有一定增加，但只有协同高剂量组具有极显著增长（p＜0.01），同时，协同高剂量组小鼠HOMA-β与空白组间无显著性差异，说明协同高剂量组小鼠胰岛β细胞所受损伤得到较好修复。葛根提取物与茶多酚在修复胰岛β细胞所受损伤具有良好的协同作用。

3 结论

本文探究了葛根提取物与茶多酚体内外的协同降血糖活性。体外辅助降血糖活性通过对α-葡萄糖苷酶活性的抑制进行测定，当葛根提取物与茶多酚质量比为2∶1时，具有最佳的协同效果，通过中效原理与联合指数计算得出两者CI<0.9，具有良好的体外协同降血糖效果。使用葛根提取物与茶多酚单独或复配后对2型糖尿病模型小鼠进行灌胃给药，进一步验证体内协同降血糖效果，在协同高剂量下给药4周后可使小鼠的血糖下降至11.1 mmol/L以下，恢复至正常值，而其他各给药组对比协同高剂量组效果略差，说明葛根提取物与茶多酚在体内同样具有良好的协同降血糖效果。同时，高剂量协同给药能够增加模型小鼠胰岛素靶器官敏感性，刺激小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素，这可能是葛根提取物与茶多酚进行协同降血糖的主要途径。

综上所述，葛根提取物与茶多酚在体内外均具有良好的协同辅助降血糖效果，可以将其活性成分进一步开发为辅助降血糖功能性食品或饮品，但其具体的作用途径与协同机制还需要进一步深入研究。