甘薯叶提取物对酪氨酸酶的抑制作用

李盼盼，杨胜祥，庞林江，陆国权

（1.浙江农林大学食品与健康学院，浙江 杭州 311300；2.浙江农林大学光机电工程学院，浙江 杭州 311300；3.浙江农林大学现代农学院，浙江 杭州 311300）

酪氨酸酶是一种结构复杂的含二价铜离子的金属酶，可催化L-多巴形成多巴醌，最终氧化生成黑色素，其广泛存在于动植物、微生物以及人体中，与果蔬酶促褐变和人体皮肤黑色素的形成密切相关[1]。人体因受到紫外线照射等影响，导致黑色素分泌增加，从而产生黑色素瘤等疾病[2]。在植物性食品中，酪氨酸酶可以催化植物酚类化合物氧化生成醌类化合物，使水果和蔬菜内部或表面产生酶促褐变，严重影响水果和蔬菜的外观和质量，降低其贮藏时间。酪氨酸酶抑制剂在化妆品及食品领域中的应用越来越广泛[3]，而常见的酪氨酸酶抑制剂如对苯二酚、熊果苷、L-抗坏血酸、鞣花酸、曲酸等在应用上表现出多种弊端，譬如对细胞潜在诱变性、皮肤接触不良反应、不稳定性、生物利用性低，甚至表现出致癌性被禁用[4]。越来越多的研究表明，植物中存在的一些活性成分对酪氨酸酶的活性有抑制作用，且在应用上比人工合成的酪氨酸酶抑制剂安全性更高，这些天然植物活性成分多数是一些高等植物在次级代谢过程中的产物或中间产物，多酚和黄酮类化合物就是其中的一种，且有关于黄酮类物质对酪氨酸酶活性有抑制作用的研究也越来越多。自然界中丰富多彩的物种资源为研究提供了大量的试验材料，从天然产物中提取活性物质为酪氨酸酶抑制剂筛选开辟了新途径[5]。吴颖等[6]研究发现，桔梗、金盏菊、蒲公英、银杏叶和茶叶5种植物提取物对酪氨酸酶有抑制作用。许兰等[7]的研究表明，茶树花提取物可以抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素生成，达到美白效果。Chang 等[8]、Yang 等[9]的研究表明，桑树枝、根皮部及桑叶提取物可以抑制酪氨酸酶活性。Gheibi等[10]的研究表明，黄酮衍生物能够可逆地抑制多巴与酪氨酸酶活性位点的结合。Bendaikha等[11]的研究表明，黄花中分离出的黄酮苷类化合物可以抑制酪氨酸酶活性。

甘薯叶主要含多酚类、黄酮类化合物等多种活性成分，但目前关于甘薯叶的研究，主要集中在其提取物活性成分的抗氧化功能方面，甘薯叶提取物对酪氨酸酶抑制作用方面的研究鲜见。若能将甘薯叶应用于食品和化妆品中或将提高其整体资源价值[12]。本试验采用不同极性溶剂提取甘薯叶中的活性成分，研究提取获得的甘薯叶活性成分对酪氨酸酶活性的影响，初步探究甘薯叶提取物对酪氨酸酶的抑制机理，为甘薯叶进一步开发并应用于功能食品、化妆品及医药等领域提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯叶：浙江农林大学东湖校区薯博园；酪氨酸酶（≥1 560 U/mg）：北京酷尔化学科技有限公司；L-多巴（标准品）、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；石油醚（沸程60℃～90℃）、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A）：上海精宏试验设备有限公司；多功能粉碎机（YB-150）：永康市速锋工贸有限公司；智能超声波清洗器（DL-400B）：上海之信仪器有限公司；真空冷冻干燥机（Biosafer-10C）：赛飞（中国）有限公司；旋转蒸发仪（R-215）：瑞士BUCHI实验室设备贸易有限公司；紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯叶不同溶剂提取物样品制备

样品制备参考邱珊莲等[13]的方法并稍作修改。将甘薯叶洗净，60℃烘干，粉碎并过80目筛，按照料液比1∶50（g/mL）加入80%乙醇，在55℃条件下超声辅助提取3次，每次50 min，合并提取液。滤液旋转蒸发浓缩至原体积的一半后，加入3倍～4倍体积的无水乙醇静置24 h，醇提液过滤，浓缩，真空冷冻干燥。将醇提物用水溶解，分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，分别得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。将不同溶剂提取液旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，并配制成不同质量浓度的抑制剂，备用。

1.3.2 酪氨酸酶抑制率及酶活力测定

参考张洪梅[14]的方法，通过测定酪氨酸酶催化L-多巴氧化速率，分别考察甘薯叶乙醇提取物及不同溶剂提取物对体外酪氨酸酶的抑制作用。酪氨酸酶活力以催化L-多巴氧化反应生成多巴醌的二酚酶活力来衡量。具体操作：试管中加入酪氨酸酶（50 U/mL）0.5 mL，pH6.8的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）2.5 mL，于37℃水浴10 min，加入0.1 mg/mL的L-多巴溶液0.5 mL，混合均匀后立即计时。在475 nm处测定光密度值（A475）随时间的变化曲线，酪氨酸酶活力单位(U/min)规定以每分钟A475增加0.001为1个酶活力单位表示，酶促反应的速度用每分钟A475增加值来表示，反应体系组成见表1，酶抑制率及相对酶活力公式如下所示。

表1 反应体系组成Table 1 Composition of reaction system mL

式中：A1为无提取物有底物时的吸光度；A2为无提取物无底物时的吸光度；A3为有提取物有底物时的吸光度；A4为有提取物无底物时的吸光度。

1.3.3 酪氨酸酶的抑制动力学分析

参考盛晓笑等[15]及马燕燕等[16]的方法研究甘薯叶提取物对酪氨酸酶的抑制效应，通过固定底物L-多巴浓度，改变加入酶溶液的浓度，考察不同质量浓度甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性的影响。为进一步研究甘薯叶提取物对酪氨酸酶的抑制动力学，通过固定酪氨酸酶液浓度，改变底物L-多巴溶液的浓度，并加入不同质量浓度的甘薯叶提取物，以底物L-多巴溶液浓度倒数1/[S]、反应初速度倒数1/v为指标，并按照Lineweaver-Burk双倒数方程进行拟合。

1.4 数据处理

采用Excel、SPSS 22.0和Origin 2019进行数据收集和处理，采用Adobe Photoshop 2021进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用

2.1.1 甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶活力的影响

不同质量浓度甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制率见图1。

底物L-多巴在酪氨酸酶的催化作用下产生多巴醌，多巴醌自动氧化生成多巴色素，反应体系颜色越深，色素生成物浓度越大[17]。由图1可知，随着甘薯叶乙醇提取物质量浓度的增加，酪氨酸酶催化底物L-多巴生成色素产物的量逐渐减少，酪氨酸酶活力逐渐下降，当甘薯叶乙醇提取物质量浓度为15.0 mg/mL时，酪氨酸酶抑制率达到61.43%，因此可看出甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用呈现浓度依赖性。根据甘薯叶乙醇提取物质量浓度对酪氨酸酶抑制率的拟合曲线可得半抑制浓度IC50约为5.53 mg/mL。

2.1.2 甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响

甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶抑制作用的进程曲线及相对酶活力见图2。

由反应进程曲线可看出，不同质量浓度甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制率趋势是一致的。随着乙醇提取物质量浓度的增加，反应生成的多巴色素的量越来越少，酶促反应受到抑制，且抑制强度随乙醇提取物质量浓度增加逐渐加大，反应15 min后反应生成物的量不再增加，底物已消耗完全，酶促反应基本结束。由相对酶活曲线可知，随着抑制剂质量浓度的增加，酪氨酸酶活力逐渐下降，当乙醇提取物质量浓度为15.0 mg/mL时，酪氨酸酶相对酶活力下降至38.57%。

2.2 甘薯叶不同溶剂萃取物对酪氨酸酶的抑制率

不同溶剂萃取物对酪氨酸酶的抑制率结果见图3。

由图3可知，不同极性萃取物对酪氨酸酶的抑制率差异很大，甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制作用最明显，抑制率达50%，这与李俊强等[18]的研究中1 mg/mL的甘草正丁醇层对酪氨酸酶抑制率大致相同。水层物质对酪氨酸酶抑制作用最弱，可能因为水层是一些蛋白质及黏性多糖类物质，活性物质含量较少[19]，对酪氨酸酶活性无影响。同质量浓度的甘薯叶石油醚层、三氯甲烷层与乙酸乙酯层物质对酪氨酸酶抑制率约为正丁醇层抑制率的5%～35%，说明了甘薯叶中对酪氨酸酶有抑制作用的活性物质主要在正丁醇层。

2.3 甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性的影响

甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性影响的进程曲线及抑制率曲线结果见图4。

由图4可知，随着正丁醇萃取物质量浓度的增加，酪氨酸酶抑制率逐渐增大，当正丁醇萃取物质量浓度为10.0 mg/mL时，酪氨酸酶抑制率可达68.57%。与10.0 mg/mL甘薯叶乙醇提取物相比，酶抑制率明显提高，这说明了以正丁醇为提取剂比乙醇能更多的富集对酪氨酸酶有抑制作用的活性物质。根据甘薯叶正丁醇萃取物质量浓度对酪氨酸酶抑制率的拟合曲线可知IC50约为4.01 mg/mL。

2.4 甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶抑制的动力学分析

2.4.1 甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制类型判断

甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶抑制作用的类型判断结果见图5。

由图5可知，随着甘薯叶正丁醇萃取物质量浓度的增加，酪氨酸酶活力逐渐下降。当体系中加入不同质量浓度的甘薯叶正丁醇萃取物时，酶浓度曲线均呈现为通过原点的直线，且直线的斜率随着甘薯叶正丁醇萃取物质量浓度的增加而逐渐减小，这说明了甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程，即甘薯叶提取物是通过与酪氨酸酶的某些必需基团以非共价键的形式结合，从而抑制了酪氨酸酶的催化活力，导致催化速率的下降，但这种结合形式并不会直接使酶分子的构象发生永久性的失活[20-21]。因此，可以明确说明甘薯叶提取物抑制酪氨酸酶的作用是可逆性抑制。

2.4.2 甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶抑制作用的动力学

甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk图见图6，甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用的米氏方程见表2。

表2 甘薯叶正丁醇萃取物对酪氨酸酶活性抑制作用的米氏方程Table 2 Michaelis equation of the inhibitory effect of n-butanol extract from sweet potato leaves on tyrosinase activity

由图6可知，双倒数图为相交于第二象限的一组直线，且直线斜率、纵截距与无抑制剂组相比均随抑制剂质量浓度的增加而增大，且由表2米氏方程可知，随抑制剂质量浓度增加，表观米氏常数Km增加，最大反应速率Vmax减小，这符合非竞争性与竞争性混合的抑制类型特征[22]，即甘薯叶提取物可以同时与游离酶和酶-底物L-多巴络合物作用。将米氏方程斜率、纵截距分别对抑制剂质量浓度二次作图，如图7、图8所示。

由图7、图8直线斜率可求得甘薯叶提取物与游离酶的解离常数KI和甘薯叶提取物与酶-底物络合物的解离常数KIS分别为0.198、0.209 mg/mL，由此可知甘薯叶提取物与游离酶的结合程度明显大于与酶-底物络合物的结合。

3 讨论与结论

本文研究结果表明甘薯叶中存在抑制酪氨酸酶的活性成分，甘薯叶提取物可进一步应用于功能性食品开发以及预防和治疗色斑疾病的药物开发等方面。甘薯叶乙醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用可达61.43%，根据其活性成分的极性的不同，采用不同极性萃取剂依次进行萃取，可以得到石油醚层、三氯甲烷层、乙酸乙酯层、正丁醇层及水层物质，进一步研究不同萃取层物质的酶抑制作用，结果表明正丁醇层物质对酪氨酸酶的抑制作用最强，且与同质量浓度的甘薯叶乙醇提取物相比，正丁醇萃取物对酪氨酸酶的抑制作用更强，说明正丁醇溶剂能将甘薯叶中抑制酪氨酸酶活性的物质更多的富集起来。进一步研究其对酪氨酸酶的抑制类型发现，甘薯叶正丁醇层物质对酪氨酸酶的抑制作用属于可逆过程，即甘薯叶正丁醇层物质与酶的作用并不会引起酶的分子构象的改变，即正丁醇溶剂萃取出的甘薯叶中的活性成分与酪氨酸酶分子是以非共价键的形式结合，但甘薯叶中的活性物质与酶分子的结合部位是否为酶分子的活性中心还需进一步研究。根据Lineweaver-Burk双倒数方程拟合结果可知，Km增加，Vmax减小，甘薯叶正丁醇层物质对酪氨酸酶的作用是非竞争性抑制与竞争性抑制混合的结果，且甘薯叶提取物与游离酶的解离常数KI小于甘薯叶提取物与酶-底物络合物的解离常数KIS，即甘薯叶提取物与游离酶的结合程度明显大于与酶-底物络合物的结合。

酪氨酸酶抑制剂可以应用于功能性食品的开发、化妆品原料的筛选、农作物的病害虫防治以及医疗等领域，但由于目前常用的酪氨酸酶抑制剂药物常出现不良反应，因此国内外学者开始将目光投入到天然酪氨酸酶抑制剂的研究与开发上，寻求特异性更好、效果更显著且安全性更高的酪氨酸酶抑制剂，研究抑制机理、抑制动力学及抑制剂应用。甘薯叶属于甘薯加工中的副产物，但往往被丢弃在田间地头，事实上甘薯叶中富含多种活性成分，而这些活性成分的研究价值远远超乎想象，合理利用甘薯叶资源，发挥其更多的研究作用，提高甘薯叶的综合利用率，拓展甘薯产业的生产空间。本研究表明了甘薯叶提取物对酪氨酸酶有抑制作用，但其提取物中的具体有效成分还不确定，今后可对甘薯叶提取物中的有效成分进行分离鉴定，研究其单体化合物对酪氨酸酶活性的影响，从而明确甘薯叶提取物对酪氨酸酶抑制作用的主要成分，并考察提取物对皮肤的刺激性，为今后甘薯叶的深加工利用提供理论依据。另外，甘薯叶提取物对酪氨酸酶分子的影响部位还不明确，后续可深入研究甘薯叶提取物与酶分子的结合部位，进一步明确甘薯叶提取物对酪氨酸酶抑制作用的机理。