中药材大蓟及混伪品的傅里叶变换红外光谱鉴别研究

单圣男，解玫莹，王兰，魏梦凌，刘想晴，程旺兴*（1.安徽中医药大学药学院，合肥20012；2.安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，合肥 20012；.安徽中医药高等专科学校药学系，安徽 芜湖241002）

我国的中药资源种类丰富多样，且中药材根源繁杂，为了确保中药在临床使用的有效性和安全性，对中药进行鉴别和质量控制十分重要。大蓟为菊科植物蓟（Cirsium japonicumFisch.ex DC.）的干燥地上部分，味甘、苦，性凉，具有凉血止血、散瘀解毒消痈的功效[1]。现代药理学表明大蓟具有凝血止血、降血压、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗糖尿病、抑菌等药理活性[2-5]。大蓟的化学成分复杂多样，主要有黄酮及黄酮苷类、长链烯炔醇类、木脂素类、甾醇类和挥发油类等。研究表明，蒙花苷和柳穿鱼叶苷等成分是大蓟发挥凝血止血作用的主要活性物质[6]。大蓟在我国分布广泛，以江苏、浙江、四川分布最多[7]。大蓟既是传统中药，又是现代临床常用中药；市场上存在着大蓟的野生品、栽培品以及部分伪品，目前市场上主要的大蓟混伪品有大蓟同科同属的小蓟及同科不同属的奶蓟草等；蓟属植物在形态上具有很高的相似性，《中国药典》对大蓟的性状描述也仅以营养期为主，使得大蓟的鉴定困难；正品、伪品两者的功效不同，若混淆使用，会直接影响用药安全。因此对大蓟的真伪鉴别显得尤为重要。

常见的真伪鉴别有性状特征鉴别、显微鉴别、理化鉴别、分子鉴别等方法[8]。性状鉴别虽过程简单，成本低廉，但主观和经验主义色彩较浓，会导致通过量低或者结果无法量化，对鉴定结果会有影响。显微鉴别从细微结构进行分析，虽弥补了性状鉴别的不足，但由于植物组织特征的相似性高[9]，凭借显微解剖特征难以解决近缘种药材的鉴定问题。理化鉴别既定性又定量，是评价药材真伪性的特定标准指标，但由于目前中药大多数有效成分不明确，且并非单一成分，因此难以规定一个合理的数值标准，药典中尚有许多药材无定量指标。与传统方法相比，DNA 分子遗传标记技术能直接分析生物的基因型，且这种方式用量非常少，但目前绝大多数动植物的DNA 序列尚未明确，加上提取的技术烦琐和相关试验的周期长，操作较为困难[10]。傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）与传统鉴别方法相比具有快速、无损、易于处理、信噪比高、重复性好等特点[11]，广泛应用于鉴别食品、中草药等混合体系[12]，中药种类不同，其组成的化学物质存在一定差异，运用适当的化学前处理，就能得到含有不同化学组成的混合物[13]，使得中药材在化学物质上的差别或不同表现在红外光谱上，从而达到鉴别中药材的目的。而将不同中药材反映在红外图谱的差异特征转化为可用计算机进行数值分析的量化特征，再用数理统计方法进行分析，即可使红外光谱的应用向定量鉴别方向更进一步[14]。采用FT-IR 法对大蓟和易混伪品进行鉴定的研究目前尚未见报道，本研究采用FT-IR 法对大蓟及其混伪品进行鉴别，初步建立大蓟药材的真伪鉴别和质量评价方法。

1 仪器与试药

Nicolet iN10 MX 傅里叶变换红外光谱仪、DTGS 检测器（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；SMART ITR 附件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；BJ-150 型高速多功能粉碎机（合肥亿心程试验设备有限公司）。无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

药材样品来源如表1 所示，将39 批样品放入烘箱中干燥，置于打粉机中进行粉碎，80 目筛过筛，备用。药材均由安徽中医药大学杨青山老师鉴定，所收集样品分别为菊科植物大蓟、小蓟和奶蓟草。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

2 方法

2.1 原始红外光谱的获取

取少量样品粉末，置于SMART ITR 附件的金刚石表面，摊平，旋转附件旋钮将样品固定并压成透明薄片。扫描波数为4000 ～500 cm－1，每次试验对样品粉末进行16 次扫描累加，扫描分辨率为4 cm－1，扫描过程中实时扣除二氧化碳和水蒸气的干扰，得到相应的红外光谱图及试验数据。

2.2 原始红外光谱图的预处理

样品的原始红外光谱图夹杂着仪器噪音和一些无效信息，会导致分析结果的准确性和精密度下降，所以应对原始图谱进行预处理，来减少各种干扰的影响。利用仪器自带的OMNIC 9.0 分析软件，对采集的红外光谱图进行光滑处理、自动基线校正和纵坐标归一化处理得到标准图谱。

2.3 精密度试验

样品连续测定5 次，得到红外光谱图并计算特征峰波数值RSD，结果显示各特征峰波数值RSD均小于1.4%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

样品每隔30 min 进行一次光谱采集，测定5次，得到红外光谱图并计算特征峰波数值RSD，结果显示各特征峰波数值RSD均小于2.6%，表明该方法的稳定性较好。

2.5 重复性试验

将样品平行制备5 份，分别测定，得到红外光谱图并计算特征峰波数值RSD，结果显示各特征峰波数值RSD均小于2.4%，表明方法重复性良好。

3 方法与结果

3.1 大蓟与混伪品的原始红外光谱图

图1 中A、B、C 为39 批样品经光滑处理、自动基线校正和坐标归一化后的红外图谱，从图中可以看出，同一中药材红外光谱图的峰形相似。

图1 大蓟及混伪品的红外光谱汇总图Fig 1 Infrared spectrum summary of Cirsium japonicum and its adulterants

3.2 大蓟与混伪品的红外光谱图

图2 为奶蓟草、小蓟和大蓟的红外光谱图，大蓟及其混伪品的红外光谱图出现多个吸收峰，整体上基本相似，主要吸收峰在3340 ～3270、2890、1705、1025、860 cm－1左右，吸收峰在1800 ～500 cm－1内较为密集。3350 ～3250 cm－1频率低谱带宽的吸收峰推测是由氨基（—NH2）和羟基（—OH）的缔合伸缩振动引起；2975 ～2887 cm－1的吸收峰推测为烷烃C-H 伸缩振动；2135 cm－1附近为C ≡C 键，1725 ～1704 cm－1附近的吸收峰推测为苯环的碳骨架伸缩振动及C ≡N、C ＝O 等伸缩振动[15]；1600 ～1574 cm－1为酰胺Ⅱ带特征吸收峰；1051 ～1024 cm－1为C-O 键伸缩振动；884 ～859 cm－1处推测为＝CH 的面外弯曲振动吸收峰，636、637 cm－1为糖环骨架振动的指纹特征峰[16]。可以看出其中样品的吸收峰的位置和强度具有一定的差异性。

图2 大蓟及混伪品的红外光谱图Fig 2 Infrared spectra of Cirsium japonicum and its adulterants

通过对药材样品的红外光谱图分析，其主要特征为：奶蓟草样品在4000 ～1800 cm－1内只出现了3 个吸收峰，且在2890 cm－1和2823 cm－1处为2 个尖峰，在2500 ～1750 cm－1处相对平缓，无C ≡C 键，由此可以与大蓟、小蓟区分。小蓟在2897 cm－1附近仅有1 个吸收峰，且在1250 cm－1附近出现多个明显的小峰。大蓟样品的红外光谱与伪品相比整体红移30 个波数左右，可作为这3 种药材的初步判断依据。

3.3 大蓟及混伪品的二阶导数红外光谱

大蓟与混伪品的红外光谱图具有一定的差别，利用二阶导数红外光谱图可以提高谱图的分辨率，采用二阶导对大蓟、小蓟和奶蓟草的红外光谱图进行分析，可以使吸收峰的宽度变为原始宽度的1/3，从而很好地将原始图形中重叠的峰分离，采用Origin 进行二阶导，Savitsky-Golay 卷曲平滑法处理，得到特征峰明显、噪音小的二阶导图谱，进而对3 种药材的图谱做进一步的观察；在红外图谱中，由于在1800 cm－1之前会受—OH 的影响，而800 cm－1之后基线漂移过大[17]，因此选择1800 ～800 cm－1进行二阶导处理。

大蓟与伪品在1800 ～800 cm－1处的二阶导数红外光谱图见图3，三者峰形和峰强均有明显差异，可用于鉴别。在1800 ～1300 cm－1和1200 ～800 cm－1处可以观察到3 种中药材在二阶导图谱上的区别：区域1 中，奶蓟草的吸收峰明显比大蓟、小蓟吸收峰强，且在区域2 中有3个明显向上的锯齿峰；小蓟与奶蓟草在区域3 处的峰形不同，小蓟有2 个向上锯齿峰，且在区域5 中的吸收峰更强；从区域4 和6 中可以看出在此范围内大蓟的吸收峰相对其他图谱红移，且在1800 ～800 cm－1处的吸收峰相对平缓。

图3 大蓟及混伪品的二阶导图谱Fig 3 Second order guide map of Cirsium japonicum and its adulterants

3.4 大蓟及混伪品的相似度分析

采用IBM SPSS26.0 统计对不同产地的大蓟进行相似度分析，结果见表2；20 批大蓟的相似度均在0.89 以上；大蓟与小蓟、奶蓟草药材进行相似度分析，结果见表3，可以看出，大蓟与奶蓟草和小蓟的相似度分别为0.421 和0.773，奶蓟草与小蓟的相似度为0.717；由此可知，不同产地大蓟的相似度均高于大蓟与奶蓟草或小蓟的相似度，可根据相似度对大蓟与伪品进行区分；其中大蓟和奶蓟草相似度较低，提示大蓟和奶蓟草的化学成分存在明显差异。

表2 大蓟相似度结果Tab 2 Similarity of Cirsium japonicum

表3 大蓟及混伪品的相似度结果Tab 3 Similarity of Cirsium japonicum and its adulterants

3.5 大蓟及混伪品的聚类分析模型的建立

使用SPSS 26.0 对样品的红外光谱图进行聚类分析，结果见图4；从图中可知，在欧氏距离为20 时，39 批样品被分为两类，大蓟单独聚为一类，小蓟和奶蓟草聚为一类；当欧氏距离为10 时，可将大蓟与混伪品分为3 类，奶蓟草聚为一类，小蓟聚为一类，大蓟聚为一类；当欧式距离为3 时，小蓟样品具有明显的地域倾向，同一产地的药材聚类时距离较近。

图4 大蓟及混伪品的聚类分析图Fig 4 Cluster analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

3.6 大蓟及混伪品的主成分分析

采用PCA 法对大蓟及易混伪品的FT-IR 图进行主成分分析，选取红外光谱在1800 ～800 cm－1内的数据，利用Origin 软件处理，得出主成分分析结果，根据特征值≥1 的原则[18]，确定2 个主成分，结果见表4。主成分1（PC1）的贡献率为94.25%，主成分2（PC2）的贡献率为4.28%，前2 个主成分PC1 和PC2 可以解释原变量98.53%的信息。即选取前2 个主成分PC1 和PC2 绘制得分图，见图5，横坐标代表主成分1（PC1）的得分值，纵坐标代表主成分2（PC2）的得分值，非常直观地观察到各类样本在主成分空间的分布情况。

图5 大蓟及混伪品的主成分分析图Fig 5 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

表4 大蓟及混伪品的主成分分析表Tab 4 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

由图5 可知，大蓟和奶蓟草明显集中地聚为单独的两组，组间互不交叉，大蓟主成分1 和2得分散点全部集中在第四象限，奶蓟草主成分1和2 得分散点全部集中在第三象限，小蓟主成分1 和2 得分散点分布在第二象限，表明大蓟和奶蓟草在主成分空间图中载荷量有显著差异。小蓟分布较为分散，可能是不同产地的小蓟质量存在差异，该结果与聚类分析结果一致。

3.7 簇类独立软模式法（SIMCA）分类模型的建立与鉴别分析

通过PCA 分析大蓟与混伪品有明显的聚类趋势，因此建立大蓟、小蓟与奶蓟草的分类识别模型，在PCA 分析的基础上，39 批样品中随机选择15 个大蓟、11 个小蓟和3 个奶蓟草组成训练集，其余5 个大蓟，3 个小蓟和2 个奶蓟草作为验证集，建立SIMCA 分类模型；模型效果用识别率和拒绝率表示，识别率是指某类样品有多少落在该模型的区域内，而拒绝率是指某类样品模型对于不属于该类的位置样品的拒绝程度[19]。从表5 中可以看出，在训练集中大蓟和奶蓟草SIMCA 分类模型对样本的识别正确率为100%，小蓟模型对样本的识别率为90.91%，大蓟的拒绝率为92.86%，有1 个小蓟样品落在了大蓟模型范围内，使该模型出现了误判；在验证集中大蓟与奶蓟草模型、小蓟模型的识别率、拒绝率均为100%。SIMCA 分类模型聚类分析图见图6，大蓟与混伪品具有较高的独立性，基本实现完全分割。一般来说，SIMCA 分类模型的正确识别率在60%以上，说明该模型可行[20]。因此，本研究建立的大蓟及混伪品的SIMCA 分类识别模型可行。

图6 大蓟及混伪品训练集（A）和验证集（B）的SIMCA 模式聚类图Fig 6 SIMCA pattern clustering diagram of Cirsium japonicum and its adulterants training（A）andverification（B）set samples

表5 SIMCA 模式的训练集与验证集结果Tab 5 Training set and verification set of SIMCA mode

4 讨论

本研究选取大蓟及混伪品小蓟、奶蓟草作为研究对象，对其进行鉴别研究，建立了一种方便、快捷、无损害的鉴别方法。在对红外光谱图的分析中发现，由于样品属于近缘物种，化学结构和化学组成都比较相似，因此原谱图之间的差异不是很明显；对红外图谱选取1800 ～800 cm－1进行二阶导处理和相似度分析，能将大蓟、小蓟和奶蓟草区分。本研究采用了FT-IR 技术结合聚类分析和SIMCA 分类模式对39 批大蓟及其混伪品进行分析研究，较好地实现了大蓟与小蓟、奶蓟草之间的分类鉴定。该方法避免了复杂的样品前处理过程，具有方便、快捷、准确等优点，有一定的可靠性和实用性，为大蓟及其混伪品的鉴别与质量研究提供了科学理论依据，具有广阔的应用前景。