不同提取方式下小蓟、小蓟炭提取物抗炎、凝血活性的比较

竺 静，陈晶晶，姚佳宁

（浙江舟山群岛新区旅游与健康职业学院，浙江舟山 316111）

小蓟Cirsium setosum(Willd.)MB.，又名刺儿菜，为多年生菊科草本植物，性味甘、苦、凉，归心、肝经。传统药学记载生品凉血、消肿效果较强，炒炭后，收敛、止血作用增强[1]。入药成分为地上干燥部分。利用现代技术提取和研究小蓟药用成分，研究表明，小蓟具有止血、凝血、抗菌、抗炎的药理活性，对心血管系统有一定的作用[2-5]。小蓟中总黄酮、正丁醇、咖啡因和绿原酸等有机成分被认为其有效药理学成分[6，7]。在小蓟有效成分中黄酮总含量在3%左右，有些地区小蓟草中其含量高达16%[8]，其中验证的黄酮种类有刺槐素(acacetin)、蒙花昔(linarin)、白杨素(chrysin)和黄琴昔(baicalin)等成分[9]。同时，小蓟草中也含有大量的有机酸类的物质，有原儿茶酸（protocatechuic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）等[10]。其他有效成分还有生物碱类、木脂素类物质和大量的植物甾醇类物质。目前，临床使用分为生品和炒炭两种形式。有效成分中黄酮在抗炎活性和凝血活性方面有很好的作用，绿原酸及咖啡酸使局部血管收缩在促进血液凝固方面起重要的作用。现临床上小蓟在治疗衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外伤出血、痈肿疮毒等方面有显著的作用[11-12]，是中医临床常用药之一。中草药提取方法有多种，其中以水为溶剂的煎煮法就是其中一种，目前，相关文献报道大多是利用化学提取法提取和分析小蓟化学成分及相关的药理作用。本文采用煎煮法、超声波化学提取法，以小蓟生品和小蓟炭为研究对象，探究两种提取方式在抗炎、止血方面的药理学差异。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

新鲜小蓟，6月份采摘当地野外，取地上部分，晾干备用（简称小蓟鲜干品或鲜小蓟）；小蓟炭，购于当地中药店；二甲苯，国药集团化学试剂厂；柠檬酸二钠，上海麦克林生化科技有限公司；氯化钙，天津致远化学致远有限公司；昆明小鼠18～22 g，雌雄各半，广东维伯鑫生物科技有限公司(提供实验鼠许可证号)，打孔器，电子分析天平；上海立辰仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 小蓟提取混悬液制备

1.2.1.1 小蓟水煎液制取

称取小蓟鲜干品50 g，捣碎，按5倍的量加入蒸馏水浸泡，4℃水箱内放置24 h后，加热100℃30 min，过滤，将滤渣再加5倍水加热 100℃ 30 min，过滤并将两次滤液混合加热浓缩至50 mL，生药含量为1 g·mL-1，调 pH值为7.6，离心后留取上清，进行高压灭菌。

1.2.1.2 小蓟炭水煎液提取

称取小蓟炭50 g，捣碎，按5倍的量加入蒸馏水浸泡，4℃水箱内放置24 h后，100℃加热30 min，过滤，将滤渣再加 5倍水加热 100℃30 min，过滤，并将两次滤液混合加热浓缩至50 mL，生药含量为1 g·mL-1，调 pH为7.6，离心后留取上清，进行高压灭菌。

1.2.1.3 小蓟超声波提取混悬液

取小蓟鲜干品粉末50 g，捣碎，加95%乙醇500 mL，浸渍24 h，低频超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣按照样品：1：10比例添加95%乙醇，超声处理30 min，过滤。如此反复提取3次，旋转蒸发器减压至适量，备用，按照浓度约为1 g·mL-1，加入生理盐水，高压灭菌备用。

1.2.2 小鼠耳廓肿胀实验

昆明小鼠，雌雄各半，40只，随机分配均分4组，即：空白对照组，小蓟水煎组，小蓟炭水煎组，小蓟超声提取混悬液。空白对照组灌胃同体积的生理盐水，其它3组分别灌胃各组相应提取液，给药剂量2 mL·10-1·g，每天固定时间分2次。3 d后，末次给药45 min后，在小鼠右耳以0.05 mL·只-1剂量，涂抹二甲苯，左耳做为对照组，脱颈处死，将双耳剪下，打孔器（直径8 mm）打孔，电子分析天平称重，以左耳右耳的质量差为肿胀度，并计算抑制率，取平均值。抑制率公式为：

抑制率=（NS组肿胀-给药肿胀）/NS组肿胀×100%。

1.2.3 小鼠脚爪肿胀实验

分组、灌药方法同1.2.2，末次给药60 min后，自左足跖中部皮下向上注入1%角叉菜0.05 mL，然后掉转针头向下注0.05 mL，测定爪肿胀量，右足不做处理，作为参照，计算方式方法同上。

1.2.4 体外抗凝血实验

实验分组如1.2.2，每组10只小鼠。取各组提取物1 mL于5 mL试管，每组加入3滴柠檬酸二钠；小鼠眼圈取血后，加入1 mL与各组试管内，然后加入25 μL 0.2 mol·L-1CaCl2混匀后，开始计时。先静置1 min，然后每隔30 s倾斜试管，至血液凝聚不能流动，则停止计时，记录各组凝血时间，每组测定4个样本。同时做小蓟炭凝血试验，方法同上。

2 结果

2.1 小鼠耳廓肿胀实验

实验结果如图1所示，小蓟水煎液、小蓟炭水煎液、小蓟超声提取混悬液对小鼠耳廓肿胀抑制率分别是13.14%、3.97%、18.11%。可见，小蓟超声提取混悬液组对小鼠耳廓肿胀抑制率最高，小蓟水煎液阻抑制率次之，小蓟炭水煎液组抑制率最低。比较之间抑制率显著性差异，小蓟水煎液组抑制率与小蓟炭水煎液组抑制率之间存在显著差异（P＜0.05），与小蓟提取物之间也存在显著性差异（P＜0.05），另外小蓟炭水煎液和小蓟超声提取混悬液的抑制率也存在显著差异（P＜0.05），3组不同提取物对小鼠耳廓肿胀的抑制各不相同。

图1 各组提取物对小鼠耳廓肿胀抑制率Fig.1 Inhibition rate of extracts from each group on ear

2.2 小鼠脚爪肿胀实验

实验结果如图2所示，新鲜小蓟水煎液、小蓟炭水煎液、小蓟超声提取混悬液对小鼠脚爪肿胀抑制率分别是11.93%、5.27%、23.66%。可见，小蓟超声提取混悬液对小鼠脚爪肿胀抑制率最高，小蓟水煎液抑制率次之，小蓟炭水煎液抑制率最低。比较之间抑制率，鲜小蓟组抑制率与小蓟炭煎剂抑制率之间存在显著差（P＜0.05），与小蓟超声提取混悬液之间也存在显著性差异（P＜0.05），小蓟炭煎液和小蓟超声提取混悬液的抑制率也存在显著差异，3组对小鼠脚爪肿胀的抑制率各不相同。

图2 各组提取物对小鼠脚爪肿胀抑制率Fig.2 Inhibition rate of swelling on paw of mice in each group

2.3 小鼠体外凝血试验

实验结果如图3所示，空白对照组、新鲜小蓟水煎液、小蓟炭水煎液、小蓟超声提取混悬液、小蓟碳粉在体外凝血试验中，测定凝血时间分别是 1.875 min、1.125 min、1.5 min、0.825 min、1.075 min。其中空白对照组所用的时间最长，小蓟炭粉所用的时间最短。实验干扰各组凝血时间明显要小于空白对照组（P＜0.05），其中鲜小蓟水煎液、小蓟炭水煎液、小蓟超声提取混悬液3组凝血时间之间差异性不大（P＞0.05），小蓟超声提取混悬液、小蓟炭粉之间凝血时间差异性不大（P＞0.05）。小蓟炭煎剂和小蓟炭粉之间凝血时间有显著性差异（P＜0.05）。

图3 小鼠体外凝血时间测定Fig.3 Determination of coagulation time in mice

3 讨论

本实验中，采用传统药物提取方式煎煮法和现代超声提取法分别小蓟、小蓟炭进行粗提，探究不同提取方式下，小蓟、小蓟炭提取物之间在抗炎与凝血方面的药理活性的差异性。由实验结果知，不同的提取方式，对小鼠耳廓、脚爪肿胀的抗炎效果与空白对照都存在显著差异（P＜0.05），说明2种提取方式都能有效提取小蓟中的抗炎药效成分。孟永海等[13]认为黑龙江产的小蓟提取部位能显著地减轻由二甲苯所致地小鼠炎症反应，具有很好的抗炎作用，且总黄酮部位显著抑制实验性炎症，小蓟的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和总黄酮部位具有不同程度的止血、凝血和抗炎作用[3]。本实验结果与文献报道一致。此外，实验中超声波乙醇法提取的提取物的抗炎效果明显优于煎煮法得到的小蓟提取物的抗炎效果（P＜0.05）。这说明超声波乙醇提取法从小蓟中提取的有效抗炎成分效果优于煎煮法。另外同样利用煎煮方式提取小蓟和小蓟炭的有效成分，耳廓和脚爪肿胀模型中，抗炎作用方面新鲜小蓟的提取物的抗炎作用优于小蓟炭提取物的抗炎活性，两者有显著差异（P＜0.05）。这可能与小蓟经过炭化后，有效药学成分发生了改变[7]。因此采用超声波提取的小蓟抗炎成分的抗炎效果较好。

中医的研究与发展过程中一直认为小蓟味微苦、甘，性凉，归肝、脾、膀胱经，有凝血祛瘀、止血的作用。常用于治疗各种血症和金疮等病症。在《食疗本草》中表述小蓟为“取菜煮食之，除风热。根，主崩中，又女子月候伤过，捣汁半升服之；金疮血不止，叶封之。”《本草拾遗》：“破宿血，止新血，暴下血，血痢，金疮出血，呕吐等，绞汁温服。”可见小蓟具有凝血、止血和抗炎的药理作用。小蓟使局部血管收缩发挥止血功能，小蓟有效止血成分是有机酸类物质与黄酮类物质。早有学者研究称黄酮苷类成分有止血作用，如芦丁（rutin），在防治视网膜出血和急性出血性肾炎等炎症方面起作用，柳穿鱼苷（pectolinaron）的止血活性较强。有机酸类物质有原儿茶酸（protocatechuic acid）、咖啡酸（protocatechuic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）等同样有止血效果，可以缩短凝血时间[14]。王志强[15]制备小蓟炭的绿原酸含量为5.38%，且经多次测定后，在180℃烘10 min时，所得成品中绿原酸含量较高且保持稳定。杨星昊等[16]验证了小蓟原料中不同有效成分对小鼠凝血和止血时间，以及实验性炎症作用的影响，此外，称小蓟的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和总黄酮部位具有不同程度的止血、凝血和抗炎作用。本实验三种提取物的抗凝血测定中，空白对照组凝血时间明显大于鲜小蓟水煎液、小蓟炭水煎液、小蓟超声波提取混悬液的凝血时间（P＜0.05），说明不同提取物都有明显止血效果，不同提取方式都能提取小蓟中有效止血成分。3组凝血作用效果为：超声波乙醇法提取小蓟的混悬液的凝血活性最好，煎煮小蓟提取物次之，煎煮小蓟炭提取物效果不佳。小蓟的抗凝血活性趋势和抗炎活性趋势一致。孙雷雷等[17]指出，小蓟在炭化后，抗炎、止血的有效成分黄酮减少，酸性成分增加。黄酮类是小蓟最重要有效成分，抗炎和止血方面都发挥主要作用。实验中3种提取物的抗炎、止血实验结果可知，在同样的提取方式下，小蓟炭煎煮作用效果均小于生品作用，可能与炭化后，黄酮成分减少有关，煎煮方式提取更进一步减少了有效成分释出，导致效果最差。

小蓟炭被普遍认为止血效果良好传统药材。据文献报道称炒炭后的小蓟中的咖啡酸，绿原酸含量高于小蓟段中的含量，这可能是小蓟炭提取物发挥凝血止血功效的原因之一[17]。可能原因是小蓟在炒炭过程中，高温破坏黄酮类物质，且随温度的升高被破坏的越严重，这是小蓟炭中几乎不含黄酮类成分，但含有咖啡酸、绿原酸、原儿茶等成分却较多。本实验通过测定，小蓟炭提取物的凝血时间最短，可能是小蓟炭粉中成分完全，有效的发挥作用有关，另外一方面活动炭具有吸附、收敛作用，炭化后植物中的钙在高温下更容易游离出来，在Ca2+离子作用下，凝血效果增强[18]。再加上血液中水分被炭吸收，血液中凝血因子浓度增加，促进凝血系统作用启动，从而凝血效果比较显著，小蓟超声波提取混悬液凝血时间1.076 mim，与之差异不大，可见超声提取方式能够有效提取药材有效成分。

综合抗炎、凝血实验结果比较，小蓟超声波提取混悬液作用效果最佳，这可能与超声波的机械、空化效应等作用下，草药中有效的成分能够充分释放，有效成分提取率较高有关[19]。因此，通过本实验结论在药材成分提取研究方面可作为一个有价值的参考。