细胞焦亡与心肌缺血再灌注损伤及中药单体干预研究进展

王益民，李焱，王怡斐，苏文革*（.山东中医药大学 第一临床医学院，济南 50000；.山东中医药大学附属医院，济南 5004）

急性心肌梗死（AMI）是导致全球心血管疾病患者死亡的主要原因之一，目前通过及时有效的溶栓、经皮冠状动脉介入（PCI）和冠状动脉旁路移植术（CABG）等治疗AMI 取得了巨大进展，缺血心肌的血运重建可恢复心肌功能，但也会产生额外的心肌损伤，称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）[1-3]。临床上，MIRI 常发生在急性ST 段抬高型心肌梗死患者中，会造成心肌的炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、内质网应激、钙超载等，引起心肌的二次损伤，增加心肌梗死面积，从而降低再灌注治疗的获益[1，4]。MIRI 的确切分子机制目前尚未完全阐明，也没有有效的药物来控制和预防。近年来研究表明，细胞焦亡与多种心血管疾病密切相关，如MIRI、动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭以及冠状动脉钙化等[5]。其中细胞焦亡在MIRI 中具有重要作用，相关机制研究和药物研究都取得了很大的进展，本文就细胞焦亡在MIRI 中的作用机制及中药单体干预研究进行综述。

1 细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡是一种伴随炎症反应的程序性细胞死亡，其特征是gasdermin D（GSDMD）介导的膜孔形成、细胞肿胀和细胞溶解，并释放大量的促炎介质，如白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等。细胞焦亡是一种非特异性先天免疫反应，不仅在抗病原微生物感染中发挥着重要作用，而且与众多非病原微生物感染也密切相关[6]。

1.1 参与细胞焦亡的关键分子

细胞焦亡的发生涉及诸多分子的参与。先天免疫反应依赖于模式识别受体（PRRs）来识别病原体相关分子模式（PAMPs）和内源性损伤相关分子模式（DAMPs）。PRRs 家族主要包括NOD 样受体（NLRs）、Toll 样受体（TLRs）和C 型血凝素受体（CLRs）。炎症小体在细胞焦亡中发挥着重要作用，参与细胞焦亡的炎症小体主要有NLRs 家族、AIM2和Pyrin，其中NLRs 家族包括NLRP3、NLRP6 和NLRP9 等，以NLRP3 的相关研究最多[7-9]。Caspase家族是一类进化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞质中多以酶原（pro-caspase）形式存在，根据其功能和结构域，可以将caspase 家族成员分为炎性caspase 和凋亡性caspase[10-11]。在gasdermin 家族中，人类拥有gasdermin A（GSDMA）、gasdermin B（GSDMB）、gasdermin C（GSDMC）、GSDMD、gasdermin E（GSDME）和DFNB59，其中GSDMD在细胞焦亡中被广泛研究，有“细胞焦亡的执行者”之称[12-14]。

1.2 经典细胞焦亡途径

经典细胞焦亡途径是由caspase-1 介导的，在PRRs 接受到PAMPs 和DAMPs 刺激后，PRRs发生寡聚化，与凋亡相关的微粒蛋白（ASC）和pro-caspase-1 聚合形成炎症小体，并激活caspase-1[13，15]。一方面，caspase-1 的激活使失活的IL-1β和IL-18 的前体裂解，产生成熟的IL-1β和IL-18；另一方面，激活的caspase-1 作用于GSDMD，并将其裂解为N 末端和C 末端产物，其中N 末端结构域是脂质选择性的，可以在细胞膜上形成孔隙，释放IL-1β、IL-18 等炎性细胞因子，从而引起细胞渗透压变化，导致炎症反应，并引起细胞膨胀、破裂、死亡[16]。

1.3 非经典细胞焦亡途径

非经典细胞焦亡途径依赖于caspase-11/4/5介导，不需要炎症小体激活，可直接作为受体与脂多糖（LPS）等分子结合而激活，活化的caspase-11/4/5 通过切割GSDMD、释放成熟的IL-1β和IL-18，从而诱导细胞焦亡的发生[17]。此外，活化的caspase-11/4/5 还可以通过Pannexin-1/ATP/P2X7 通路，介导NLRP3/ASC/caspase-1 活化，促进IL-1β和IL-18 成熟和释放，诱导细胞焦亡的发生[18]。

1.4 其他细胞焦亡途径

近年来研究发现，活化的caspase-3 可通过切割GSDME 并促进GSDME-N 结构域向细胞膜聚集，来诱导细胞膜孔隙的形成，从而导致细胞焦亡[19]。Caspase-8 对依赖于NLRP3 的caspase-1 通路起正向调节作用，还可以作为caspase-3 的上游蛋白或者直接切割GSDMD 或GSDME 来诱导细胞焦亡[20]。颗粒酶A 或B 可以取代caspase 的“传统效应”，裂解gasdermin 蛋白家族，进而诱导细胞焦亡[21]。

2 细胞焦亡与MIRI

MIRI 的病理生理学涉及多种细胞的参与，如心肌细胞、心肌成纤维细胞、血管内皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等[22]。根据最新的研究结果，心房区域含有约30.1%的心肌细胞、24.3%的心肌成纤维细胞和12.2%的血管内皮细胞；心室区域含有约49.2%的心肌细胞、15.5%的心肌成纤维细胞和7.8%的血管内皮细胞[23]。这三类细胞占整个心肌组织细胞总数的70%左右，深入了解这三类细胞在MIRI 中的焦亡机制，可为MIRI 的治疗提供新方向。

2.1 细胞焦亡与心肌细胞

心肌细胞的炎症和坏死在MIRI 的病理生理过程中起关键作用。根据最新的研究，心肌缺血再灌注可诱导心肌细胞焦亡，其中氧化应激是关键诱导因素，并主要通过caspase-11/GSDMD 信号通路来介导心肌细胞焦亡，这个过程伴随着成熟的IL-18 的释放，并且GSDMD基因敲除和GSDMD 抑制剂均可显著减轻心肌细胞焦亡所致的心肌损伤[24]。有研究证明相关蛋白也可介导MIRI 中的心肌细胞焦亡的发生，如水通道蛋白4（AQP4）介导了MIRI 中心肌细胞焦亡，AQP4 抑制剂可通过抑制心肌细胞焦亡来减轻MIRI；甲基转移酶样蛋白3（METTL3）通过6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰促进RNA 绑定蛋白DiGeorge 关键区域8（DGCR8）与pri-miR-143-3p 的结合，从而增强miR-143-3p 的表达，抑制蛋白激酶C-epsilon（PRKCE）转录，导致MIRI 中的心肌细胞焦亡[25-26]。这些研究提示抑制caspase-11/GSDMD 信号通路是治疗MIRI 中心肌细胞焦亡的核心，未来的药物研究可以该通路作为研究对象；多种相关蛋白也参与到了MIRI 中心肌细胞焦亡的发生，如AQP4 和METTL3 等，进一步探讨这些蛋白对焦亡的调控机制，可为MIRI 的治疗提供新靶点。

2.2 细胞焦亡与心肌成纤维细胞

心肌成纤维细胞是心肌组织中含量最丰富的非心肌细胞，它可以感知心脏损伤或应激时释放的危险信号，在维持心脏正常功能方面具有重要作用[27]。在心肌缺血再灌注中可通过活性氧（ROS）产生和K＋外流介导心肌成纤维细胞中NLRP3 炎症小体激活，诱导心肌成纤维细胞焦亡[28]。近年来研究发现，长链非编码RNA GAS5（LncRNA GAS5）的DNMT1 沉默可以激活NLRP3 炎症小体，导致心肌成纤维细胞焦亡，从而促进心肌纤维化的进展[29]。在心肌成纤维细胞中，环氧合酶-2（COX-2）参与了NLRP3 炎症小体的激活，沉默COX-2基因或使用COX-2 抑制剂均降低了NLRP3 炎症小体和下游细胞因子的表达和激活[30]。在缺氧/复氧（H/R）条件下，心肌成纤维细胞可分泌含有miR-133a 的外泌体，递送到心肌细胞中，靶向ELAV 样RNA 结合蛋白1（ELAVL1）并抑制心肌细胞焦亡[31]。由此可见，NLRP3 炎症小体的激活是MIRI 时心肌成纤维细胞焦亡的关键，NLRP3 炎症小体是MIRI 极具潜力的治疗靶点。另外，进一步揭示心肌成纤维细胞在MIRI 时对心肌组织的自我保护机制，或许是未来的研究方向。

2.3 细胞焦亡与血管内皮细胞

血管内皮细胞对H/R 的变化极为敏感，其功能障碍是导致MIRI 的重要病理基础之一。有研究表明，在H/R 诱导下，心肌微血管内皮细胞可发生焦亡，其机制与NLRP3/caspase-1 介导的IL-1β分泌有关[32]。在小鼠MIRI 模型中，自噬相关基因BECN1可以调节caspase-4 介导心肌微血管内皮细胞焦亡[33]。也有研究指出，抑制促炎因子的释放、降低ROS 表达和抑制NLRP3 炎症小体的激活，可降低心肌血管内皮细胞的焦亡水平[34]。血管内皮细胞损伤可再次导致冠状动脉血管功能障碍，因此抑制MIRI 中血管内皮细胞损伤极具意义。抑制血管内皮细胞内的炎症反应，降低ROS 水平，进而降低血管内皮细胞的焦亡水平，可减轻MIRI。

3 中药单体对MIRI 中细胞焦亡的作用机制研究

3.1 黄酮类化合物

柚皮苷是存在于柚子皮、化橘红、骨碎补等中药材中的一种黄酮类化合物，研究发现柚皮苷具有抗炎、抗氧化应激、清除自由基等作用，对心脑血管疾病具有潜在的应用价值[35-36]。王婷婷等[37]研究发现，在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，柚皮苷低剂量（10 mg·kg－1）、中剂量（50 mg·kg－1）、高剂量（100 mg·kg－1）组心肌组织中caspase-1、NLRP3、ASC 以及GSDMD 蛋白的表达水平均比模型组降低，其发挥心肌保护作用与降低心肌组织的细胞焦亡水平有关。提示柚皮苷可通过抑制细胞焦亡进而减轻MIRI，但其抑制细胞焦亡的具体调控机制尚不清楚，有待进一步验证。

芹菜素是存在于芹菜、车前子、络石藤等中药材中的一种黄酮类化合物，具有抗动脉粥样硬化、抗高血压以及抗自身免疫性心肌炎等多种药理学作用[38]。Li 等[39]研究发现在缺血/缺氧（I/H）处理的大鼠心肌细胞（H9C2 细胞系）模型中，芹菜素可呈剂量依赖性降低NLRP3、caspase-1、GSDME-N、IL-1β和IL-18 的表达水平，其发挥心肌保护作用可能与抑制心肌细胞焦亡有关。然而芹菜素抑制MIRI 中细胞焦亡的具体作用机制还需进一步研究。

木犀草素是存在于野菊花、金银花、紫苏叶等中药材中的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗高血压和心脏保护等作用[40]。Zhang 等[41]研究发现在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 处理的H9C2 细胞系模型中，木犀草素有效地抑制了心肌细胞中NLRP3、ASC、caspase-1、Toll 样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）的表达，其心肌保护机制也可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路介导的细胞焦亡有关。体内外实验均显示木犀草素对MIRI 具有较强的心脏保护作用，未来可进一步探索其临床应用价值。

3.2 萜类化合物

獐牙菜苷是从龙胆科植物獐牙菜中提取的一种环烯醚萜类化合物，具有强大的抗氧化和抗炎活性[42]。Li 等[43]研究发现在雄性Wistar 大鼠MIRI 和H/R 处理的H9C2 细胞系模型中，獐牙菜苷能抑制Kelch 样ECH 相关蛋白1（Keap1）并诱导核因子E2 相关因子2（Nrf2）核易位，降低NLRP3、ASC、caspase-1 和IL-1β的表达水平，能显著抑制心肌细胞焦亡，并发现通过抑制Nrf2 的表达可以消除其对心肌细胞焦亡的抑制作用，推测獐牙菜苷可能通过调节Keap1/Nrf2 轴抑制细胞焦亡，进而发挥心肌保护作用。研究还发现，獐牙菜苷对心肌细胞焦亡的抑制作用部分受Keap1/Nrf2 轴的调节，这表明还有其他途径参与了抗焦亡作用，尚需要进一步的实验来确证其抗焦亡作用的最强或最具潜力的途径[43]。

3.3 香豆素类化合物

秦皮甲素是从中药秦皮中提取的一种香豆素类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多种药理学作用[44]。Xu 等[45]研究发现在雄性SD 大鼠MIRI 和接受氧气-葡萄糖剥夺/恢复（OGD/R）处理的新生大鼠心肌细胞（NRCM）模型中，秦皮甲素可通过AKT/GSK3β/NF-κB 通路抑制NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡，从而减轻MIRI 和OGD/R 诱导的心肌细胞损伤。同时还发现秦皮甲素（30 mg·kg－1）治疗组在减轻再灌注心律失常、心肌损伤和恢复血流动力学功能方面与硝苯地平（10 mg·kg－1）治疗组没有明显差异，这些结果证实了秦皮甲素可有效减轻MIRI，是极具前途的治疗MIRI 的候选药物。

3.4 醌类化合物

大黄素是从中药大黄根茎中提取的一种蒽醌类化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗纤维化等药理作用，在心血管疾病方面具有极大的应用潜力[46-47]。Ye 等[48]研究发现，在雄性SD 大鼠MIRI 和H/R 处理的心肌细胞模型中，大黄素可减少心肌细胞中ROS 的产生，降低TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3 和GSDMD-N 的表达，进而抑制心肌细胞焦亡，其作用是通过抑制TLR4/MyD88/NFκB/NLRP3 通路实现的。提示大黄素是治疗MIRI的候选药物，TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 通路可能包含MIRI 的重要治疗靶点。然而，大黄素介导的肝肾等器官毒性的细胞和分子机制仍不明确，还需要进一步研究其临床应用价值[49-50]。

3.5 生物碱类化合物

胡椒碱是存在于黑胡椒和长胡椒中的一种生物碱类化合物，现有研究已经证实其具有抑制心肌纤维化、减少线粒体氧化应激、清除ROS 以及扩张血管等诸多心脏保护作用[51]。Guo 等[52]研究发现在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，胡椒碱可降低心肌组织的细胞焦亡水平，其机制与胡椒碱抑制了miR-383 的表达和促进RP105/PI3K/AKT通路的激活有关，并提示miR-383 通过RP105/PI3K/AKT 依赖的方式调节MIRI 中的细胞焦亡。miRNA 是一种高度保守的非编码RNA，可通过直接结合3' UTR 来抑制靶mRNA，从而导致心肌细胞焦亡和MIRI[53]。胡椒碱可通过调控miRNA，进而抑制MIRI 中的细胞焦亡，为我们从miRNA角度研究细胞焦亡和MIRI 之间的关系以及药物作用机制提供了思路。

3.6 酚类化合物

丹皮酚是从毛茛科植物牡丹的根皮中提取的一种酚类化合物，具有抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞、保护心肌细胞以及抑制心肌纤维化等多种药理学作用[54]。丁华胜等[55]研究发现在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，丹皮酚预处理可呈剂量依赖性地抑制TLR4 的表达及核转录因子NF-κB的活化，降低NLRP3/ASC/caspase-1 介导的心肌组织的细胞焦亡水平，减轻MIRI。丹皮酚作为治疗心血管疾病极具潜力的候选药物，未来可结合临床试验进一步评价其在MIRI 中的治疗价值。

3.7 有机酸类化合物

肉桂酸是从中药肉桂皮中提取的一种有机酸类化合物，具有广泛的药理学作用，如抗氧化、抗炎、心脏保护、神经保护等，对心血管疾病具有潜在的治疗作用[56-57]。Peng 等[58]研究发现在雄性SD 大鼠MIRI 模型中，肉桂酸能抑制MIRI 后大鼠心肌的炎症反应，减轻心肌损伤，缩小心肌梗死面积，改善心功能，其机制主要表现为下调NLRP3、ASC、IL-1β、caspase-1 和GSDMD-N 蛋白的表达，显著抑制心肌组织中NLRP3 炎症小体的激活和随后的心肌细胞焦亡。提示肉桂酸可通过抑制心肌细胞焦亡来减轻MIRI，并具有良好的心肌保护活性，但其治疗和预防MIRI 的能力尚需要进一步的系统评价和临床试验来验证。

3.8 苷类化合物

天麻素是从中药天麻中提取的一种糖苷类化合物，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多种药理学作用，广泛应用于心脑血管疾病的治疗[59-60]。Sun 等[32]研究发现在雄性C57BL/6J 小鼠MIRI 和H/R 处理的人心脏微血管内皮细胞系（HCMECs）模型中，天麻素可通过抑制NLRP3/caspase-1 信号通路，降低心肌组织和HCMECs 的焦亡水平，减少炎性细胞浸润，具有心肌保护作用。由此可见，天麻素可通过抑制经典细胞焦亡途径发挥心肌保护作用，然而天麻素调节细胞焦亡的深层分子机制还需进一步探索。

4 小结与展望

细胞焦亡是MIRI 的重要机制之一，从细胞焦亡角度探讨MIRI 的治疗或许是一个潜在策略[61]。虽然目前还没有开发出治疗MIRI 的特异性药物，但中药单体中多种天然化合物均显示出抗MIRI 活性，为寻找特异性抗MIRI 的药物提供了选择。多种中药单体抗MIRI 已经进行了大量的基础研究，在发挥抗炎、抗氧化应激、抑制钙超载、调节心肌能量代谢、改善血管内皮功能以及调节线粒体功能等方面具有重要作用[62]，但目前临床推广极少，也导致其实用价值下降。药物制剂的创新或许有利于药物的临床推广，可以考虑将中药单体与纳米药物递送系统相结合[63]，在临床试验中以提高药物靶向性，并减少不良反应。

结合目前的研究，多种中药单体的体内外实验均显示出抗MIRI 中细胞焦亡活性，为下一步开发治疗MIRI 的特异性药物奠定了坚实基础。但我们仍然可以看到以下不足：

① 机制研究不深入：目前的研究多是基于聚合酶链式反应（PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）来检测基因或蛋白表达的层面，未来可利用基因敲除或抑制关键蛋白等研究来验证中药单体的作用靶点，还可利用分子对接技术等结构药理学方法揭示中药单体的结合位点，进一步阐明中药单体的具体作用机制。

② 模型构建待改进：由于MIRI 特定的发病状态，体外实验模型构建存在一定的难度。目前OGD/R、H/R 等造模方式缺乏神经体液调节，并不能完全模拟MIRI 期间的病理生理变化，可能会对实验结果造成一定的偏差。未来的研究可进一步改进实验模型，并选择公认的模型进行实验研究。

③ 药理研究不完善：除了完善对中药单体的药物效应动力学研究外，还应进一步研究药物代谢动力学以及药物毒理学等内容，完善对中药单体的药理学研究。

④ 临床试验尚缺乏：目前对中药单体的研究多是基于细胞实验和动物实验，尚未有临床试验的证据支持，未来还需要进一步的临床试验来证明中药单体的安全性和有效性。

总之，中医药在治疗MIRI 中显示出巨大的应用潜力，虽然目前仍处于基础研究阶段，还存在诸多问题需要解决，但我们应开拓研究思路，进一步结合新技术、新方法，开发治疗MIRI 的新药物。