lncRNA NEAT1促进宫颈癌发展的作用及机制研究

李怡琳梅 劼 郭晓霞 雷 华 江廖治 凌 波 江 虹②

（四川省人民医院，电子科技大学附属医院，成都 610000）

宫颈癌包括宫颈鳞癌和宫颈腺癌，是一种宫颈上皮细胞恶性增殖导致的妇科恶性肿瘤，发病率逐年升高，手术切除或放化疗后极易再次复发，预后不佳，成为严重困扰女性健康的社会公共问题之一［1］。虽然宫颈癌的筛查以及疫苗预防等方面有了较为明显的进展，但具体发病机制尚未完全阐明，尚未出现针对该病的根治性治疗措施，因此深入揭示疾病的分子机制，寻找宫颈癌特有的分子标志物，为患者开展基因靶向治疗成为目前宫颈癌研究的热点之一［2］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200 bp具有种属特异性的非编码RNA。近来研究显示lncRNA通过干预相关基因的转录与表达，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中发挥促癌或抑癌的作用［3］。近来长链非编码核富含丰富的转录本1（long non-coding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1）在肺癌、胃癌等多种肿瘤中过表达，且与肿瘤的增殖以及病情进展密切相关引起广泛关注［4］。CHEN等［5］研究显示lncRNA NEAT1在非小细胞肺癌中高表达，并增强肿瘤细胞的增殖能力，推动肿瘤病情进展。QUAN等［6］研究表明乳腺癌患者血清中lncRNA NEAT1的水平升高，可作为肿瘤预后不良的生物标志物。但有关lncRNA NEAT1在宫颈癌中的作用报道较少。本研究以宫颈癌组织和宫颈肿瘤细胞HeLa作为研究对象，研究lncRNA NEAT1在宫颈癌中的表达情况，揭示其对肿瘤细胞增殖的影响机制，为宫颈癌的靶基因治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料选取2018年3月至2020年3月在四川省人民医院进行外科切除病灶的宫颈癌患者50例，所有患者均为原发性宫颈癌患者，且经病理验证为首次确诊者，年龄25～73，平均（30.53±8.67）岁，入选患者均未经放化疗、免疫或激素干预，排除其他部位恶性肿瘤以及自身免疫性疾病［7］。另取同期50例因子宫平滑肌瘤（宫颈无任何病变）等良性疾病而切除子宫的正常宫颈组织作为对照，年龄22～76，平均（31.25±9.48）岁，本研究已获得患者或家属的知情同意书，且经医院伦理委员会批准。

1.1.2 实验动物、细胞及主要试剂人宫颈癌细胞HeLa购自美国菌种保藏中心（ATCC）；沉默lnc-RNA NEAT1表 达 的lncRNA NEAT1-siRNA以 及 阴性对照（lncRNA NEAT1-siRNA-NC）由上海吉凯生物技术有限公司提供。兔抗大鼠磷酸化组蛋白（γ-H2AX）、毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白激酶（ataxia-telangiectasia mutated kinase，ATM）抗体（美国Jackson公司）；CCK-8试剂盒、Western blot试剂盒（美国Invitrogen公司）；苏净Airtech超净工作台（美国Thermo Fisher公司），BD-56集成式恒温恒湿细胞培养箱（德国BINDER公司）；ⅨPlore Standard倒置显微镜（日本Olympus公司）；凝胶自动成像系统（美国Sigma-Aldrich公司）；实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 应用在线生物数据库检索lncRNA NEAT1表达从GEO中提取GSE63514和GSE6791两个宫颈癌芯片数据，通过R软件分析lncRNAs在正常组织和肿瘤组织中的表达，确定在两个数据集中表达差异最为明显的lncRNA；利用UALCAN分析lnc-RNA NEAT1表达对宫颈癌患者生存期的影响［8］。

1.2.2 qRT-PCR进行验证使用Trizol试剂盒分别提取宫颈癌组织和正常宫颈组织中总的RNA，根据Prime ScripTM试剂要求逆转录生成反义cDNA，以此为模板采用PCR仪进行扩增（95℃5 s，单次循环后；95℃5 s；60℃60 s，采集荧 光 信号40个 循环）［9］；U6作为内参（正向引物为5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，反向引物为5'-CCCCAGAGACATGATGAAGTCA-3'），lncRNA NEAT1（正向引物为5'-CACCATGGGAGAAGGCCGGGG-3'，反向引物为5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'），各目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3 lncRNA NEAT1的表达与宫颈癌患者临床病理相关指标的关系提取入选患者的临床病理资料，将lncRNA NEAT1的表达与患者的年龄、肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期、组织学分级情况进行统计分析。

1.2.4 细胞培养、转染以及分组处理将人HeLa细胞株复苏后，接种于含有灭活的10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于恒温恒湿生化培养箱中培养，设定条件：37℃，5%CO2，当细胞生长密度达85%时开始实验。本研究中细胞实验分为3组［10］：正常组、对照组、实验组。正常组：不加任何药物，常规培养；对照组：细胞转染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA-NC后，常规培养；实验组：细胞转染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA后，常规培养。

1.2.5 CCK-8法检测各组细胞的增殖调整细胞浓度，以1×104个/孔接种于96孔培养板，分组处理同上，轻轻混匀后，在恒温恒湿生化培养箱常规培养24 h后，每孔加入100μl的CCK-8试剂，孵育2 h，使用多功能酶标仪测定OD450［11］，每组连续测量4 d。

1.2.6 DNA ladder分析各组细胞DNA的损伤情况将细胞调整3×105个/ml接种6孔板，分组处理同1.2.4，37℃、5%CO2条件下继续培养24 h后，添加细胞裂解液，留取上清，依次添加适量Tris液、RNA酶，在50 V下进行琼脂糖凝胶电泳，常温染色，紫外灯下拍照，自动成像系统分析条带的相对强度，以表示细胞DNA的损伤情况［12］。

1.2.7 流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和细胞凋亡率调整细胞3×105个/ml接种6孔板，分组处理同1.2.4，37℃、5%CO2条件下继续培养24 h后，PBS缓冲液将各组细胞重悬，以70%乙醇固定，离心后，弃上清，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色［13］，PBS重悬，避光孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化。

调整细胞浓度3×105个/ml接种6孔板，分组处理同1.2.4，37℃、5%CO2条件下继续培养24 h后，PBS缓冲液将各组细胞重悬，滴加5μl的V-FITC和5μl的PI染色［14］，避光孵育，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.8 裸鼠皮下种植瘤模型检测各组细胞的体内生长调整细胞浓度，分组同1.2.4，以1×106个/孔接种后，在恒温恒湿生化培养箱继续培养，待生长密度达到1×107个/ml时，制成单细胞悬液，进行动物实验。使用异氟烷将SD雌鼠麻醉，在裸鼠右前肢近胸腔处进行消毒、备皮，使用100μl的注射器进行皮下注射［15］，4周后脱颈处死裸鼠，无菌剥离瘤体，称重。

1.2.9 Western blot检测各组细胞中γ-H2AX、ATM蛋白表达水平胰酶消化细胞，离心稀释成单细胞悬液，分组处理同1.2.4，按1×105个/孔接种至6孔板；置于5%CO2、37℃培养箱24 h，加入蛋白裂解液，分别提取各组细胞的总蛋白，测定浓度，置于沸水中变性，进行电泳分离，转膜，清洗后，在封闭液中孵育30 min，加入一抗（1∶500），孵育过夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色［16］，以GAPDH作为内参，Image J图像分析软件统计分析各条带的灰度值。

1.3 统计学分析SPSS19.0对实验数据进行统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验进行分析；所有数据符合正态分布检验，计数资料采用χ2检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA NEAT1在宫颈癌中表达升高宫颈癌组织和正常组织间存在表达差异的lncRNA（图1），进一步采用维恩图对两基因芯片中的表达上调或下调的lncRNA进行说明（图2A），发现lncRNA NEAT1在两芯片中的表达均明显升高（图2B、C）；UALCAN分析显示lncRNA NEAT1低表达患者的生存期优于lncRNA NEAT1高表达患者（图2D），说明在宫颈癌中lncRNA NEAT1的研究具有潜在临床价值。

图1 宫颈癌组织和正常组织差异表达的lncRNAFig.1 Differentially expressed lncRNA in cervical cancer tissue and normal tissue

图2 lncRNA NEAT1表达Fig.2 Expression of lncRNA NEAT1

2.2 qRT-PCR结果qRT-PCR结果显示，与正常宫颈组织（1.04±0.15）相比，lncRNA NEAT1在宫颈癌组织中的相对表达量（2.27±0.41）明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 lncRNA NEAT1表达Fig.3 Expression of lncRNA NEAT1

2.3 lncRNA NEAT1表达与宫颈癌患者临床病理相关指标的关系统计分析结果显示，lncRNA NEAT1的相对表达与宫颈癌患者的肿瘤大小、组织学分级相关（均P＜0.05），与患者的年龄、组织类型、TNM临床分期、浸润深度无关（P＞0.05），见表1。

表1 lncRNA NEAT1的相对表达与宫颈癌患者的临床病理参数的关系Tab.1 Relationship between relative expression of lnc-RNA NEAT1 and clinicopathological parameters of cervical cancer patients

2.4 CCK-8法检测各组细胞的增殖CCK-8实验结果显示，从检测第2天后，与正常组相比，实验组细胞的OD450值明显下降，增殖能力明显下降（均P＜0.05）。正常组与对照组，差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

图4 CCK-8实验结果Fig.4 Experimental results of CCK-8

2.5 DNA ladder分析各组细胞DNA的损伤情况琼脂糖凝胶电泳结果显示，正常组和对照组细胞呈现一条较明显的DNA大分子片段，实验组细胞DNA出现3～4条200 bp、400 bp、800 bp、1 000 bp的区带，即细胞凋亡独有的“阶梯图谱”，说明实验组细胞的DNA链断裂严重，DNA损伤明显，见图5。

图5 DNA ladder分析实验结果Fig.5 Experimental results of DNA ladder analysis

2.6 流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和细胞凋亡率流式细胞术结果显示，与正常组相比，实验组中处于G1期的细胞的比例明显下降，处于S期细胞的比例明显升高，形成S期阻滞，细胞凋亡率明显升高（均P＜0.05），正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图6、图7。

图6 各组细胞的细胞周期Fig.6 Cell cycle of Cells in each group

图7 各组细胞的细胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis of each group

2.7 皮下种植瘤结果比较 皮下种植瘤实验结果如图8所示，与正常组相比，4周后，实验组裸鼠内移植瘤明显变小，瘤体重量明显降低（P＜0.05），正常组与对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图8 皮下种植瘤实验结果Fig.8 Experimental results of subcutaneous tumor implantation

2.8 Western blot检测各组细胞中DNA损伤标志物Western blot结果显示，与正常组相比，实验组细胞γ-H2AX、ATM蛋白表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P＜0.05），正常组与对照组，差异无统计学意义（P＞0.05），见图9。

图9 Western blot结果Fig.9 Results of Western blot

3 讨论

随着宫颈细胞学与病毒学的进步，宫颈癌的早期筛查率有了较为明显的突破，在一定程度减轻了对女性群体的威胁。但技术仍有地区并未开展宫颈癌筛查或筛查项目严重不足，导致宫颈癌仍是困扰发展中地区和国家女性健康的癌症类型之一［17］。手术与放化疗是宫颈癌的主要治疗措施，但由于肿瘤细胞旺盛的生命力，肿瘤复发率不断攀升，患者预后不佳，因此基因靶向治疗成为提高患者生命质量的最有前景的治疗方案之一［18］。目前众多研究宫颈癌发生、发展的分子机制，开展多方面的实验，积极寻找癌细胞恶性增殖的分子标志物。

lncRNA NEAT1又被称为HSALNG0000014，定位在染色体11q13.1。研究显示作为细胞旁斑结构的主要构成部分，lncRNA NEAT1在维系肿瘤细胞内蛋白-mRNA结构的稳定性中发挥重要作用［19］。深入研究发现在胶质瘤、结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中高表达的lncRNA NEAT1明显增强癌细胞的生长与增殖能力，加快肿瘤细胞的免疫浸润及患者的病情进展［20］。CHEN等［5］研究显示，在非小细胞癌中，抑制lncRNA NEAT1的表达能明显抑制肿瘤细胞的生长与侵袭能力，诱导细胞凋亡。LI等［21］研究表明沉默lncRNA NEAT1的表达能明显降低乳腺癌细胞在小鼠成瘤模型中的体内生长。WANG等［22］研究表明结肠癌患者血清中lncRNA NEAT1明显升高，也是患者预后不良的独立评价因子。本研究从LncExpDB数据中发现lncRNA NEAT1在宫颈癌细胞系中呈现高表达状态。对GEO数据库GSE6791和GSE63514宫颈癌患者芯片的研究发现lncRNA NEAT1在两组数据集中的表达明显升高。进一步对本研究收集的宫颈癌组织标本研究发现，lncRNA NEAT1的表达升高，并且lncRNA NEAT1的表达与患者肿瘤大小以及组织学分级相关，说明lncRNA NEAT1的表达与宫颈癌的病情进展关系密切。沉默其表达后，HeLa细胞的DNA损伤明显，细胞的有丝分裂被阻滞在S期，体外增殖与体内生长明显受限，细胞的凋亡率明显升高。

细胞的DNA为双链闭环超螺旋结构，是遗传物质的载体。其结构的稳定是肿瘤细胞恶性生物学功能的基础［23］。DNA损伤是指细胞有丝分裂过程中DNA较为稳定的核苷酸序列出现永久性的改变，进而影响染色体复制以及基因转录、翻译。DNA双链结构受损是导致细胞周期调控紊乱进而使细胞趋于凋亡的主要原因。γ-H2AX、ATM蛋白是DNA双链结构受损的生物标志物［24］。TAIANA等［25］研究报道在多发性骨髓瘤中lncRNA NEAT1维系DNA结构稳定，并帮助肿瘤细胞进行DNA损伤修复。本研究表明沉默lncRNA NEAT1的表达后，HeLa的DNA双链结构受损明显，有序的细胞分裂阻滞在S期，细胞凋亡率升高。说明沉默lncRNA NEAT1有望成为潜在的宫颈癌细胞的DNA损伤修复抑制剂，给宫颈癌的靶向治疗带来新的靶点。

综上，在宫颈癌组织中lncRNA NEAT1的表达明显升高，沉默其表达后，宫颈癌细胞的HeLa细胞的DNA损伤明显，细胞周期被阻滞在S期，体外增殖与体内生长明显受限，细胞的凋亡率明显升高。但是开展lncRNA NEAT1靶向治疗宫颈癌仍需大样本以及多维度的系统研究。