沉默转录因子YY1表达对胶原诱导的关节炎小鼠肠道菌群的影响①

江仁权 汤纪丰 何毓珏 俞子晴 林锦骠（福建医科大学附属第一医院检验科，福建医科大学基因诊断研究中心，福建省检验医学重点实验室，福州 350005）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全阐明［1］。最新研究表明肠道菌群与RA的发生密切相关。我国学者通过对RA患者口腔和肠道微生物进行元基因组分析时发现，口腔和肠道微生物菌群的异常是RA病理生理过程中的重要环节。在RA患者中某种嗜血杆菌呈现相对缺失的状态，而乳杆菌在RA患者的牙菌斑、唾液和粪便中均显著富集，这在病情高度活动的患者中表现得尤为明显［2］；另有研究人员通过比较RA患者和健康者粪便样本中的肠道细菌发现，RA初诊患者所携带的普氏菌数量较健康者或慢性、接受治疗的RA患者多［3］；节状丝菌可通过与幼稚T细胞的TCR受体结合诱导小鼠固有层中Th17的极化和活化，继而诱发自身免疫反应和炎症性关节炎［4］。以上研究均表明肠道菌群失调是RA发病的重要因素。课题组的前期研究发现，转录因子YY1可通过炎症因子IL-6调控Th17分化参与RA发病［5］。那么在RA中，YY1发挥的作用是否与肠道菌群有关？本研究首先拟构建RA的疾病动物模型胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠，通过YY1干扰慢病毒处理CIA小鼠，采用RT-PCR、16S rRNA高通量测序和微生物多样性分析等方法探讨沉默YY1表达对CIA小鼠肠道菌群的影响，以期为阐明YY1在RA发病中的作用、完善RA的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料DBA/1J小鼠购自上海斯莱克公司；鸡Ⅱ型胶原（chicken typeⅡcollagen，CⅡ）购自Chondrex公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich公司；小鼠Ficoll分离液购自北京索莱宝公司；TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；SYBR GreenPremix Ex Taq PCR试剂购自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1；YY1干扰慢病毒由上海吉玛制药技术有限公司提供，所使用的慢病毒载体为pGLVH1/GFP载体，shRNA序列见表2。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

表2 慢病毒shRNA序列信息Tab.2 Sequence information of lentivirus shRNA

1.2 方法

1.2.1 CIA小鼠动物模型的建立采用CⅡ免疫6～8周的DBA/1J雄性小鼠，初次免疫在小鼠尾根部皮内注射CⅡ，总量为150μg/只。21 d后，避开初次免疫部位，尾根部皮内再次注射CⅡ进行加强免疫，总量为75μg/只。小鼠在加强免疫约10 d后陆续出现症状，按随机抽样法分为对照组（LV-NC处理）和YY1沉默组（LV-YY1-shRNA处理），6～8只/组，并通过尾静脉注射慢病毒（1×108TU/只）处理CIA小鼠。

1.2.2 CIA小鼠关节炎症评分和标本采集对CIA小鼠进行关节和关节外病变观察及关节炎评分，各关节病变程度按5级评分法。0分：无红肿；1分：关节红不肿；2分：关节轻度红肿；3分：关节中度红肿；4分：关节重度红肿伴功能障碍。关节炎分数（arthritis score，AS）为每只DBA/1J小鼠所有病变关节分数的总和，最高分为16分。在初次免疫后的第36～62天内采取双盲法每3 d评分1次，同时记录得分。在初次免疫62 d后，颈椎脱臼法处死所有小鼠，留取小鼠外周血和肠道粪便，并使用小鼠Ficoll分离液分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）进行mRNA表达检测，肠道粪便送华大基因进行16S rRNA高通量测序。

1.2.3 PBMCs提取小鼠外周血中加入等量生理盐水，轻轻混匀后将其加至小鼠Ficoll分离液的液面上，2 000 r/min离心20 min；离心后，离心管由上至下分为4层：第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。第二层环状乳白色淋巴细胞层即为小鼠PBMCs，吸管小心吸取后立即加入TRIzol进行RNA提取。

1.2.4 RT-PCR分析采用苯酚-氯仿法抽提取小鼠PBMCs的总RNA，通过逆转录试剂盒逆转录获取cDNA，逆转录条件为：在总RNA样本中加入Oligo（dT）引物后充分混匀，PCR仪65℃扩增5 min；待反应完成后按试剂盒说明书加入dNTP、逆转录酶及RNA酶抑制剂等在PCR仪上42℃反应60 min，70℃反应5 min后4℃保存。目标基因表达水平的检测采用SYBR Green法，以cDNA为模板，扩增条件：95℃预变性30 s；随后95℃变性10 s，62℃退火30 s，重复40个循环。以β-actin为内参基因，2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达水平。

1.2.5 肠道菌群测序根据试剂盒说明书，采用QIAamp®DNA Stool Mini Kit提取小鼠肠道粪便总基因组DNA，采用16S rRNA通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）进行扩增。纯化后的扩增产物使用MiSeq测序仪进行测序。

1.2.6 肠道菌群多样性分析测序结果采用Microbial Ecology相关软件和数据库进行分析，包括Prinseq、FLASH、PEAR、Mothur、Usearch、Cytoscape、R和RDP classifier等软件，RDP、Silva和NCBI 16S database等数据库。Chao、ACE、Shannon和Simpson指数由Mothur软件计算产生［6］。菌属多样性分析采用RDP classifier分析软件。菌群分布采用STAMP软件分析。

1.3 统计学分析采用Graphad Prism 8.0软件进行统计分析及作图。正态分布的计量资料组间比较采用独立样本t检验。所有假设检验比较均为双侧，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默YY1表达可减轻CIA小鼠炎症反应采用YY1干扰慢病毒处理CIA小鼠观察YY1对其发病的影响。结果显示与对照组相比，沉默YY1表达后CIA小鼠炎症评分降低（图1A）。同时，检测小鼠PBMCs中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-17等基因的相对表达量，结果显示沉默YY1表达后TNF-α、IFN-γ和IL-6基因表达量降低（图1B）。以上结果表明，在CIA小鼠中干扰YY1表达后可能通过降低炎症因子表达减轻关节炎症反应。

图1 沉默YY1表达可减轻CIA小鼠炎症反应Fig.1 Silencing expression of YY1 could attenuate inflammation in CIA mice

2.2 肠道菌群丰度和多样性分析ACE、Chao和Richness指数在NC组和YY1干扰慢病毒处理组间无明显差异（图2A～C、F～H）；而相比NC组，YY1干扰慢病毒处理组小鼠中Shannon指数增加，Simpson指数降低（图2D、E、I、J）。该结果表明，YY1干扰慢病毒处理CIA小鼠不改变肠道菌群的丰度，但对菌群的多样性有一定影响。

图2 CIA小鼠肠道菌群丰度和多样性分析Fig.2 Analysis of abundance and diversity of gut flora in CIA mice

2.3 肠道菌群种属差异分析 分析小鼠肠道菌群的种属差异，观察YY1慢病毒干扰后对哪些菌群产生影响。结果显示，小鼠肠道菌群中占主要的菌属为Barnesiella、Escherichia/Shigella和Lactobacillus，在NC组分别为21.91%、20.08%和11.79%（图3A），而在YY1慢病毒干扰组分别为22.82%、9.10%和7.98%（图3B）。而Intestinimonas（P=0.040）和Acetobacteroides（P=0.040）菌属在NC组和YY1慢病毒干扰组之间差异有统计学意义（图4）。

图3 CIA小鼠肠道菌群分布Fig.3 Distribution of gut flora in CIA mice

图4 肠道菌群分布差异图Fig.4 Difference maps of gut flora distributions

2.4 肠道菌群的功能差异预测分析已知沉默YY1表达可引起肠道菌群的分布差异，通过京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）对微生物基因组的基因功能构成进行分析，探究肠道菌群的改变是否会引起功能改变。结果显示磷酸代谢和丙二酚降解等功能在NC组和YY1慢病毒干扰组间存在差异（图5）。

图5 肠道菌群的功能差异图Fig.5 Difference maps of gut flora functions

3 讨论

肠道微生物基因组被称作人体的“第二基因组”，现有研究发现，肠道微生物群除了可将碳水化合物转化为短链脂肪酸外，还可调节宿主免疫功能和维持稳态，广泛参与人体的生理病理过程，与癌症发生、代谢综合征、心血管疾病、自身免疫病等均密切相关［7-11］。不仅如此，大量研究还提示肠道菌群参与机体免疫系统的调节与重塑。例如，脆弱拟杆菌（人体肠道中一种常见的共生菌）可通过一种特殊的分子polysaccharide A活化Toll样受体2（Toll-like receptors 2，TLR2）信号通路，抑制辅助性细胞（T helper）17分化，同时激活调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），进而通过产生IL-10抑制炎症反应的发生来参与免疫调节［12］。梭菌属也有类似的诱导Treg分化的功能［13］。由此可见，肠道微生物群参与机体免疫调节和相应疾病的发生发展。

在肠道菌群与RA的相关研究中发现肠道菌群与RA的发生有关。研究者利用无菌小鼠模型，选择性地将不同种属的微生物注射到无菌环境培养的小鼠体内，并观察微生物对关节炎模型小鼠的影响。结果显示，革兰阴性的大肠埃希菌、拟杆菌对关节炎的发生具有保护作用，而革兰阳性的双歧杆菌、乳酸杆菌则会加重关节炎的进展［14］。另外，研究人员利用肠道共生菌Prevotellahisticola治疗关节炎小鼠，发现其可有效减轻小鼠的关节炎症状［15］。还有研究报道表明肠道微生物柯林斯氏菌（Collinsella）和小鼠关节炎症状直接相关，在患者发病早期阶段，打破肠道菌群的平衡会引起RA的发生［15］。表明肠道微生物的失调是RA发病的重要因素，调节肠道微生物菌群有望为RA治疗提供新思路［16］。

YY1是一种具有双重转录活性的核转录因子，在恶性肿瘤的发生发展和转移中起重要作用［17］，但其在自身免疫病中的研究还较少。课题组的前期研究证实了转录因子YY1在RA患者中表达升高，其不仅可调控IL-6的转录表达促进Th17分化，还可调控IL-8表达促进中性粒细胞迁移，共同参与RA发病［5，18］。然而，YY1是否与RA中肠道菌群的变化有关尚不明确。为阐明YY1和肠道菌群在RA发病中的作用，课题组首先构建了RA的疾病动物模型CIA小鼠，并采用YY1干扰慢病毒处理CIA小鼠来沉默YY1表达。结果观察到沉默YY1表达后，CIA小鼠的关节炎症水平减轻，且相关的炎症因子TNF-α、IFN-γ和IL-6基因表达量降低，该结果表明在CIA小鼠中沉默YY1表达可减轻其炎症反应，延缓疾病进展。进一步探讨沉默YY1表达是否与CIA小鼠中肠道菌群的变化有关。采用16S rRNA高通量测序对CIA小鼠肠道粪便进行测序并分析，发现在CIA小鼠中沉默YY1表达后不改变肠道菌群丰度，但对菌群的多样性有一定影响。CIA小鼠的肠道菌群中以Barnesiella、Escherichia/Shigella和Lactobacillus菌属居多。相比对照组，沉默YY1表达的CIA小鼠肠道中的Intestinimonas和Acetobacteroides菌属增多。提示沉默YY1表达抑制CIA小鼠的炎症反应可能与肠道菌群的改变有关，干预肠道菌群有望成为治疗RA的新思路。

本研究尚存在一定的局限性，课题组虽然发现Intestinimonas和Acetobacteroides菌 属在沉默YY1表达的CIA小鼠中发生改变，但其是否与炎症因子的改变有关？沉默YY1表达具体是如何改变肠道菌群的？这些问题仍有待后续研究解决。

综上所述，在CIA小鼠中，沉默YY1表达可降低TNF-α、IFN-γ和IL-6等炎症因子表达，增加Intestinimonas和Acetobacteroides菌属丰度，从而延缓疾病进展，靶向干预YY1或者肠道菌群可为RA的治疗提供新方向。